| 研究課題/領域番号 |
25305010
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
沢辺 京子 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 部長 (10215923)
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| 研究分担者 |
伊澤 晴彦 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (90370965)
佐々木 年則 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (10300930)
水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
比嘉 由紀子 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (40404561)
山内 健生 兵庫県立大学, 付置研究所, 准教授 (00363036)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蚊媒介性ウイルス / マダニ媒介性ウイルス / RDV法 / 次世代シークエンサー / アルボウイルス分布図 / リスクマップ作製 / 国際情報交換 |
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| 研究実績の概要 |
2010年フィリピンのルソン島各地において捕集されたクロヤブカ属雌成虫を用いてC6/36細胞に接種しウイルス分離を行った結果、強い細胞変性効果（CPE）が観察された。しかし、既知のアルボウイルスプライマーを用いたRT-PCRではウイルス種同定には至らなかったため、次世代シークエンサーを用いた網羅的な配列解析を行った。CPEが観察された細胞の培養上清を回収し、濃縮および精製を行った後にヌクレアーゼによる細胞由来核酸の除去を行った。さらにヌクレアーゼ処理後の溶液からRNAを抽出し、cDNAの合成ならびに増幅を行い、Miseqによるde novoシークエンスを行った。その結果、ピコルナウイルス様の配列が見出され、総リード数の過半数を占めていた。その他に、Tanay virusやソベモウイルス様の配列が見出された。現在は、得られた配列をもとにウイルスゲノム全長の決定し、分子系統解析や電子顕微鏡による観察を試みており、分離されたウイルス種の同定を目指している。
ロンドン自然史博物館およびオックスフォード大学自然史博物館において、東南アジア産吸血性双翅目昆虫の標本調査を実施した。本件により、東南アジア産の節足動物の分類が可能になった。フィリピンルソン島南西部のLaguna省、Cavite省、Quezon省においてフランネル法によりマダニの採集を行った。草地、落ち葉のつもった林内、牧場等、持ち主の許可が得られた場合のみ家畜より直接採集を行った。1ヵ所あたり4もしくは5名で30分間行った。計11ヵ所で採集し、採集個体はラボに持ち帰り同定した。結果、少なくとも7箇所でオウシマダニが採集され、旗摺り法では幼虫のみ採集された。家畜（牛）からは若虫及び成虫が採集された。採集個体はウイルス分離に供した。国内では、サシチョウバエが十数匹しか得られず、ウイルス分離も結果が出なかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フィリピンの捕集蚊からからは、ピコルナウイルス様の配列、Tanay virusやソベモウイルス様の配列を見出し、得られた配列をもとにウイルスゲノム全長の決定し、分子系統解析や電子顕微鏡による観察を試み、分離されたウイルス種の同定を目指している。
一方で、本年度に計画した、バングラデシュでのサシチョウバエ捕集、ならびにフィリピンでのマダニ捕集に関しては、いずれも少数の個体しか得ることができなかった。少ない検体数ではあったが、それらからウイルス分離を試みたが、結果は得られなかったため、次年度に捕集方法を検討し、できるだけ多くの個体を入手できるようにする。
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| 今後の研究の推進方策 |
・蚊およびマダニからのウイルス分離を継続し、分離株においてはさらに詳細なウイルス学的解析を進める。
・フィリピンのルソン島とミンドロ島において動物寄生性マダニ類の調査を実施し、できるだけ多くのマダニの捕集を試みる。
・通常サシチョウバエの捕集に用いられるオイルトラップで得られる個体は、ウイルス分離に適していないことが予想されるため、バングラデシュにおいて、捕集方法を検討し、できるだけ多くの個体の捕集を試みる。
・国内捕集蚊およびマダニからのウイルス分離法を確立し、海外産個体からの分離に応用する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度、デング熱国内感染が発生したため、その対策に追われ海外渡航が計画通りに行われなかった。また、フィリピンおよびバングラデシュにおけるマダニとサシチョウバエのいずれも捕集数が少なかったため、場所の選定と方法を検討する必要があり、調査の日程を調整することが難しかった。本年度は、主にフィリピンのルソン島とミンドロ島において動物寄生性マダニ類の調査を実施する予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
１．消耗品費：前年度と同様に計上する。１）ウイルス分離に関わるディスポーザブル危惧、ガラスシャーレ、培地等）２）次世代・第三世代シークエンス解析に関わる消耗品
２．海外旅費：フィリピンにおいて2度の調査を計画したため、それに伴う渡航費、滞在費およひ現地協力者への謝金等を計上する。
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