| 研究課題/領域番号 |
25340030
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
茂木 章 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80452332)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | DNA損傷トレランス / 複製後修復 / 相同組換え / ユビキチン |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、新しいDNA損傷トレランス機構と考えられる「鋳型乗換え経路」の分子的実態と機能の解明を行うことを目的とする。
A. 鋳型乗換え経路に関与すると考えられるユビキチンリガーゼ(E3)SHPRHと損傷乗越え経路で中心的に働くE3であるRAD18との二重変異株、及びSHPRHとDNA鎖間架橋損傷修復の主要な修復経路であるファンコニ貧血経路の中心因子FANCCとの二重欠損株を作製し、機能解析を進めた。また、SHPRH遺伝子変異の効果を確認するためにトリSHPRH cDNAを再導入した細胞株を作製した。
B-1. 鋳型乗換え経路に関与する可能性のある新規ヘリカーゼZRANB3変異株の主要なDNA損傷剤に対する感受性を解析した。また、SHPRHとZRANB3の遺伝的関係を解析するためにSHPRH/ZRANB3二重変異株を作製した。
B-2.「家族性乳がんの原因遺伝子の一つであるBRCA1に変異をもったがんは、ポリ(ADP)リボシル化(PAR化)阻害剤に対して高感受性である」ことの作用機序を検証するためにSHPRH/BRCA1二重変異株を作製した。SHPRH/BRCA1変異株は、BRCA1単独変異株に比べてDNA二本鎖切断を起こすガンマ線に対する感受性は変わらないのに対して、PARP阻害剤オラパリブに対する感受性が大幅に増強することが明らかになった。このことは、SHPRHはBRCA1とは独立にPAR阻害剤によって誘導されるDNA損傷の修復を促進する因子である可能性を示唆する。このsynthetic lethalityの機能的意義をさらに解明するために、株相同組換えにおいてBRCA1より下流で働く別の家族性乳がんの原因遺伝子であるBRCA2との条件変異株を作製した。
C. 前年度に作製したPOLH/REV3/POLK及びPOLH/REV1/POLKの3TLS変異株から薬剤選択マーカーを除去し、さらにSHPRHの片アリル変異細胞株を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
A. SHPRH変異株のターゲット効率を測定し、概ね想定通りの結果を得た。また、SHPRH変異株、SHPRH/RAD18二重変異株、及びSHPRH/FANCC二重変異株にトリSHPRH cDNAを再導入した細胞を作製した。
B-1. ZRANB3変異株の各種DNA損傷に対する感受性の解析が終了し、ガンマ線、 DNA鎖間架橋損傷剤シスプラチン、ポリ(ADP)リボシル化(PAR化)阻害剤オラパリブに顕著な感受性を示さないことがわかった。ZRANB3変異株のターゲット効率を測定した。また、SHPRH/ZRANB3二重変異株の解析に取り掛かった。トリZRANB3遺伝子は5’末端の配列がヒト相同遺伝子と大きく異なることがわかったため、cDNAクローニングした配列が正しいものであることを確認する作業を行っている。
B-2. SHPRH/BRCA1変異株は、BRCA1単独変異株に比べてガンマ線に対する感受性は変わらないことに対して、PAR阻害剤オラパリブに対する感受性が大幅に増強していた。SHPRH/BRCA1二重変異株のOVA 遺伝子ターゲット効率は、77%(27/35)で、BRCA1単独変異株より高かった。また、SHPRH/BRCA1変異株にトリSHPRH cDNAを再導入した細胞を作製した。SHPRH/BRCA1二重変異株に強い表現系が認められたため、この方向の解析を強化し、SHPRH/BRCA2条件二重変異株及び、SHPRH/PARP-1/BRCA2条件三重変異株を作製した。
C. 前年度に作成したPOLH/REV3/POLK及びPOLH/REV1/POLKの3TLS変異株から薬剤選択マーカーを除去するのに時間を要したが、作製できたので、さらにSHPRHの片アリル変異細胞株を作製した。
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| 今後の研究の推進方策 |
A. SHPRH/RAD18二重変異株、及びSHPRH/FANCC二重欠損株の各種細胞表現型、機能解析(染色体断裂率、突然変異率、損傷局所へのユビキチンの集積、相同組換え効率など)の解析を行う。また、これらの細胞株にトリSHPRH cDNAを再導入した細胞株を作製したので、遺伝子再導入によってSHPRH変異の機能回復が見られることを確認する。
B-1. SHPRH/ZRANB3二重変異株の各種表型、機能解析を行う。トリZRANB3 cDNAクローニングを完了し、ZRANB3変異株で見られた表現系を確認するためにトリZRANB3遺伝子を再導入した細胞株を作製する。
B-2. SHPRH/BRCA1二重変異株、SHPRH/BRCA2条件二重変異株、及びSHPRH/BRCA2/PARP-1条件三重変異株を作成したので、これらの細胞株の主なDNA損傷剤に対する感受性を検討する。また、上記の各種表型、機能解析を行い、総括する。また、連携研究者である益谷美都子博士との共同研究によって、PARP-1及びPAR分解酵素PARGがDNA二本鎖切断末端のresectionを抑制することで非相同末端結合を促進することがわかったので、それらの知見を総括する。
C. 薬剤選択マーカーを除去したPOLH/REV3/POLK及びPOLH/REV1/POLK変異株を用いてSHPRH変異を加えた四重変異株を作成する。その後、それらの株の各種表型、機能解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
多重変異細胞株の作製と確認に予定より時間がかかった。また、SHPRH/BRCA1二重変異株に強い表現系が認められたため、この方向の解析を強化するための新たな変異株を作製することに変更した。これらの変更に伴い、トリ及びヒト細胞株の各種解析に必要な消耗品の購入が次年度に繰り越された。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度に繰り越された計画を実行する予定である。
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