| 研究課題/領域番号 |
25340030
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
茂木 章 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80452332)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | DNA損傷トレランス / 複製後修復 / 相同組換え / ユビキチン |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、新しいDNA損傷トレランス機構と考えられる「鋳型乗換え経路」の分子的実態と機能の解明を行うことを目的とする。
A. 鋳型乗換え経路に関与すると考えられるユビキチンリガーゼ(E3)SHPRHと損傷乗越え経路で中心的に働くE3であるRAD18との二重変異株、及びSHPRHとDNA鎖間架橋損傷修復の主要な修復経路であるファンコニ貧血経路の中心因子FANCCとの二重欠損株を作製し、機能解析を進めた。鋳型乗換え経路に関与する可能性のある新規ヘリカーゼZRANB3の単独変異株及びSHPRH/ZRANB3二重変異株を作製した。また、遺伝子再導入による表現系の回復をより厳密に比較するためにFlp-Inシステムを用いてオブアルブミン遺伝子座に遺伝子再導入できる系を作成し、各種細胞株に導入している。
B. 家族性乳がんの原因遺伝子の一つであるBRCA1とSHPRHの二重変異株は、BRCA1単独変異株に比べてPARP阻害剤オラパリブに対する感受性が大幅に亢進することが明らかになった。このことは、SHPRHがBRCA1とは独立にPARP阻害剤によって誘導されるDNA損傷の修復を促進する因子である可能性を示唆する。このsynthetic lethalityの機能的意義、分子機序の解明は取り組むべきことが非常に多いために今後の発展課題とするが、作用機序の可能性の一つとして、PARP-1がDNA二本鎖切断部位のresectionを抑制する仕組みの解明を行っている。
C. POLH/REV3/POLK/SHPRH及びPOLH/REV1/POLK/SHPRHの四重変異細胞株を作製した。これらの細胞株の表現系解析及び遺伝子再導入による表現系の回復を検討している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
A. 遺伝子再導入系(OVA-FRT-LacZeo)の構築及びその導入に時間を要した。サザンブロットにより野生株及びSHPRH変異株へのノックインが確認できたので、この部位にトリSHPRH遺伝子を再導入している。ZRANB3単独変異株の標的組換え効率の低下は見られなかった。また、ZRANB3遺伝子破壊株の機能解析及び遺伝子再導入を行っている。
B. SHPRH/BRCA1二重変異株の薬剤選択マーカーを除去した細胞株を作成したので、OVA-FRT-LacZeoによる遺伝子再導入を行っている。また、連携研究者である益谷美都子博士との共同研究によって、PARP-1が相同組換え抑制性クロマチン結合因子53BP1をDNA二本鎖切断末端にリクルートすることによってエンドヌクレアーゼCtIP によるresectionを抑制することを見出し投稿準備中である。また、CtIPの発現低下が、PARP阻害剤に対するがん細胞の感受性を増強することを論文発表した。
C. POLH/REV3/POLK/SHPRH及びPOLH/REV1/POLK/SHPRHの四重変異細胞株は生存可能であることがわかったので、現在これらの細胞株の表現系解析を行っている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
A.SHPRHと各種遺伝子との二重変異細胞株に対してOVA-FRT-LacZeoを用いた遺伝子再導入を行い、表現型の回復程度の再評価を行い、今年度中に総括する。
B. SHPRH/BRCA1二重変異株がPARP阻害剤に対する高感受性を示すことの分子機序の解析は今後より多くの詳細な解析が必要と思われるので、本課題以降の中心課題とする。PARP-1及びPARGによるresection抑制機序の解析として、53BP1の損傷部位への集積の動態及びPARP-1の酵素活性の必要性について検討し、今年度中に総括する。
C. A. B.の総括を優先し、POLH/REV3/POLK/SHPRH及びPOLH/REV1/POLK/SHPRHの四重変異細胞株の各種表型、機能解析を可能な範囲で行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画にある細胞変異株の作成・機能解析を概ね実施したが、各種変異遺伝子を再導入した株間の表現系の差をより厳密に比較するために、Flp-Inシステムを用いた遺伝子再導入を行える細胞株を作成し追加実験を実施する予定である。これらの細胞株をもちいた解析結果を得次第、投稿予定である。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
変異株の作成・確認ためのトランスフェクション、サザンブロット試薬など40万円、細胞培地、血清、培養関連消耗品など40万円、組換え蛋白質の分離解析のための試薬、抗体など40万円、論文投稿費、印刷代10万の計130万円。
|
