| 研究課題/領域番号 |
25340036
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
久保 喜平 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (40117619)
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| 研究分担者 |
竹中 重雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (10280067)
山本 亮平 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (20457998)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 塩基除去修復 / MPG / DNA損傷 / タンパク質相互作用 / ＤＮＡ修復 / マウス胎児線維芽細胞 / ＨｅＬａ細胞 / ノックダウン細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究はメチルプリングリコシラーゼ（MPG）によって開始される塩基除去修復（BER）の制御機構解明を目的としている。アルキル化剤 (MMS)処理後、マウス胎児線維芽細胞（MEF）のPolβ欠損株（Polβ-KO）のBERを野生株（WT）のそれと比較した。Polβ-KOでは、Polβに加えてMpg、ApexおよびPCNAが著しく低下していたため、修復中間体である脱塩基（AP）部位数もWTに比べて有意に少なかった。また、処理24時間後の残存メチル化塩基数は、有意に多かった。Polβ-KO下のlong-patch修復の寄与を、その必須酵素であるFen1を二重にノックダウンしたPolβ-KO/Fen1-KD細胞により検討した。得られたFen1-KD細胞およびPolβ-KO/ Fen1-KD細胞のいずれにおいてもFen1は検出されなかった。Fen1-KD細胞ではFen1-KD細胞ほど顕著ではないが、MS感受性の有意な増加が観察された。一方、Polβ-KO/ Fen1-KD細胞は、Polβ-KO細胞と同程度の感受性であった。Polβ-KO細胞では、BER関連たんぱく質の著しい低下があることから、long-patch修復の寄与も少ないと考えられる。この結果は、コメットアッセイによる両者のBER中間産物量にも差がなかったことと一致する。これに対して、作成したApex-KD細胞のMMS感受性の増加は高濃度領域でのみ見られたのに対して、Polβ-KO/Apex-KD細胞では、Polβ-KOに比べて低濃度領域から有意な感受性増加が認められた。したがって、Apexは、Pol関与BERにおけるとは別個の機能を担っていることが考えられる。FLAG-Mpgの強制発現MEFを用いたMpg結合性タンパク質のLC/MS解析により、新たにp53、Rpa1、Rpa2およびHsc70が同定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
リコンビナントGST-Mpgによる、HeLa細胞抽出液中のMpg結合性タンパク質検索により同定されたXRCC1、MBD1およびPCNA等に加えて、FLAG-Mpgの強制発現MEFを用いて新たに4種のタンパク質の同定に成功した。この際、従来用いてきたMALDI/TOFMSに替えて、使用が可能になったLC/MSを解析に用いた。FLAG-Mpg発現MEF抽出液の二次元電気泳動法による解析により、MMS処理後これまでに同定したものに加えて、さらに多くの発現量変化の認められる未同定タンパク質スポットが観察された。これらは同定中である。Apex、Fen1およびPolβノックダウン（KD）MEF株を作出し、さらにPolβ-KO/Apex-KDおよびPolβ-KO/ Fen1-KD MEF株を得て、MMS損傷のBERにおけるその役割について検討を行った。その結果、long-patch BERに必須のFen1がほとんど検出されないFen1-KD MEFでは、MMS濃度1mM以上では、WTに比べてわずかながらも有意な感受性増加を認めたが、Polβ-KO/ Fen1-KD MEFでは、Polβ-KOに比べて有意な増加を示さなかった。この結果より、MEFにおけるlong-patch BERの寄与はPolβ依存性の主経路であるshort-patch BERに比べてはるかに寄与が小さいことが考えられる。これに対して、Polβ-KO/Apex-KD MEFのMMS感受性は低濃度からPolβ-KOに比べて顕著であり、これはPolβ-KOで低下していたApexがさらに Apex-KDにより一層著しく低下していたことから、Apexが単に同一の経路に属するPolβの上流タンパクであるという以外の、重要な役割を有することを強く示唆する。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題の解明のために、今後は、1）ノックダウン細胞および欠損細胞を用いた研究結果を踏まえて、特にMMSによる損傷発生初期に機能する核内制御因子とMPGの相互作用について研究を進める。2）作製したHeLa細胞を用いたFLAG-MPG強制発現系を用いてMPGと相互作用をする核内因子を、プルダウン法および免疫沈降法により分離、同定する。この際、MEFにおける解析に用いる抗マウスMpg抗体については、市販のものも含めて検討した結果、特異性の高いものが得られないことより、HeLa細胞を主な対象とし抗ヒトMPG抗体を用いて検討を行う。3）MPGのin vitroアセチル化処理およびリン酸化処理を行い、これによるS期細胞抽出物との複合体形成に及ぼす影響を検討する。4）MMS処理後に、MPG複合体領域に集簇するタンパク因子の解析を行う。5）MBD1等のノックダウン細胞を作出する。これらの細胞のG1期およびS期におけるMMS処理による複合体形成動態を調べる。6）DNA損傷導入時のp53、APE1やpolβタンパク量レベルの上昇と、MPGレベルの連動性および複合体形成機序について検討する。7）メチル損傷のBERの初期過程に関わる細胞内諸因子について明らかにし、MPGの抑制的制御とBER開始に関わるタンパク因子による統合的制御機構について総括する。
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