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2014 年度 実施状況報告書

ヌクレオチド除去修復によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階の解析

研究課題

研究課題/領域番号 25340039
研究機関岡山理科大学

研究代表者

池田 正五  岡山理科大学, 理学部, 教授 (10176092)

研究分担者 河野 真二  岡山理科大学, 理学部, 助教 (00600222)
研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワードヌクレオチド除去修復 / アルキル化損傷 / 塩基除去修復 / 分裂酵母 / 損傷認識
研究実績の概要

昨年に引き続き、ヌクレオチド除去修復(NER)によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、分裂酵母を用いて遺伝学的および生化学的に解析した。ゲノム全体を対象としたNERの初期過程に働くrph7とrhp41について、塩基除去修復(BER)でAPサイトに働くnth1とのエピスタシス解析を、脱アミノ剤で種々の変異体を処理して行った。脱アミノ剤はシトシンをウラシルに変換し、さらにウラシルDNAグリコシラーゼによりAPサイトになる。それぞれの単独欠損株よりも、nth1/rph7およびnth1/rhp41欠損株は脱アミノ剤に対して感受性になった。したがって、Rhp7p とRhp41pはDNAグリコシラーゼによって生じたAPサイトを認識してNERに導いていることが判明した。さらに、NERエンドヌクレアーゼRad13pはRad2p(ヒトのFEN1ホモログ)とUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。Rhp7p/Rph16p複合体の遺伝子は互いに逆向きに隣接している。これらのプロモーターをレポーターアッセイで測定した。rph16プロモーターはレポーターアッセイでUV誘導性のみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導された。種々のDNA損傷に対する誘導性は、Rhp16pがUV損傷以外の修復にも関わっていることを示唆する。rph7プロモーターはこれまでの所、UV誘導性を観察できていない。NERにかかわるヘテロ二量体のRhp41p/Rhp23p(XPC/HR23)とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10p(XPF/ERCC1)を大腸菌で共発現させる系を作製したが、両者ともかなりのタンパク質が不溶性で、現在、培養や抽出方法を検討している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成26年度は、遺伝学的な解析とDNA損傷応答の解析は予測通りの進行具合で実施することができた。すなわち、Rph7pとRhp41pがBERの初発酵素であるDNAグリコシラーゼの作用で生じたAPサイトを認識してNER過程に導いていることを明らかにすることができた。また、NERエンドヌクレアーゼRad13pとRad2pがUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。さらに、rph16とrph7プロモーターのレポーターアッセイ系を構築し、rph16プロモーターがUVのみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導されることを示した。これにより、DNA損傷に応答するエレメントの同定に発展させることができる。しかし、生化学的解析では苦戦している。Rhp41p/Rhp23p複合体とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10pを大腸菌で共発現させる系では、両者ともかなりのタンパク質が不溶性となり、これら因子の精製に手間取っている。

今後の研究の推進方策

平成27年度は最終年度であり、当初の方針通りに研究を進める。まず、これまでに完了していない遺伝学的解析を行う。さらに大腸菌で発現させたNER因子の精製・機能解析などの生化学的解析行う予定である。最後に、研究の成果を英語論文にまとめたい。

次年度使用額が生じた理由

予算の9割以上を使用したが、今年度は出張回数が1回であったり、既存の試薬類を使うことができたので、約30万円の繰越金ができた。

次年度使用額の使用計画

今年度の研究で用いる比較的高価な試薬の購入に充てる予定である。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] Global Genome Nucleotide Excision Repair Proteins Rhp7p and Rhp41p are Involved in Abasic Site Repair of Schizosaccharomyces pombe.2015

    • 著者名/発表者名
      Eiji Sakurai, Miyuki Susuki, Kyoichiro Kanamitsu, Shinji Kawano, Shogo Ikeda
    • 雑誌名

      Advances in Bioscience and Biotechnology

      巻: 6 ページ: 265-274

    • DOI

      10.4236/abb.2015.64026

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] 分裂酵母細胞の経時寿命における塩基除去修復の役割の解析2014

    • 著者名/発表者名
      妹尾 聖典、河野 真二、池田 正五
    • 学会等名
      日本分子生物学会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] アルキル化損傷DNAの修復ネットワークの解析2014

    • 著者名/発表者名
      池田正五、河野真二、草野貴雄、櫻井詠司
    • 学会等名
      OUSフォーラム
    • 発表場所
      岡山
    • 年月日
      2014-11-21 – 2014-11-21
  • [学会発表] 分裂酵母のヌクレオチド除去修復によるアルキル化損傷DNAの 修復初期過程に働く因子の機能と遺伝子発現制御2014

    • 著者名/発表者名
      櫻井 詠司、須々木 深雪、河野 真二、池田 正五
    • 学会等名
      日本生化学会
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      2014-10-15 – 2014-10-18

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公開日: 2016-05-27  

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