研究課題
DNA 二本鎖切断(DSB)は、主として非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)によって修復される。HRの反応は、まず5’側のDNA鎖の削り込み(DNA end resection) により3’の一本鎖が露出することから始まる。HR反応には組換えの相手となる姉妹染色分体が必須のため、S期後期とG2期でのみ起こりうると考えられてきた。申請者はS期におけるDNA未複製領域に生じたDSBの修復に関しては新規の概念が必要であると考え、本研究によりこれを検証している。前年度までに、姉妹染色分体を持たない（DNAが複製されていない）G1期細胞でも、ヒト骨肉腫細胞U2OSとヒト不死化正常繊維芽細胞1BR-hTERTではともに30 %前後が削り込み活性を保持している事を明らかにした。さらに、このG1期での削り込み活性もCtIPに依存していることを明らかにした (DNA repair. 2013)。CtIPはresection反応の始動の段階で機能するため、resection活性の細胞周期制御を解明する上でも重要な因子である。CtIPがresectionの始動以外の機能を持っている可能性に関して詳細に検討を進めた。その結果、放射線照射後の長時間に渡って低レベルのリン酸化状態を維持しながらCtIPがフォーカスを形成しており、そのリン酸化はATMだけでなくATRにも制御されていると考えられること、DNA損傷後にはCtIPの分解が始まり、DSB部位では新規合成されたCtIPタンパク質の積極的なリクルートが絶えず続いていると考えられることなどを明らかにした（Mutat Res, 2015）。これらのことからCtIPはresectionが進行した後にも何らかの役割を果たしていると考えられ、resection 後の修復過程の解析に重要な知見を得られた。
2: おおむね順調に進展している
細胞周期におけるresection活性の制御を明らかにしていくために、まず G1 期（複製開始以前）での活性をはっきりとさせることが重要であるため、重粒子線の特質を活用して検証を進め、成果を論文発表した（DNA repair, 2013）。G1期のCtIP依存的なresection活性に関しては、2014年になって少なくとも海外の２グループから同様の結果の報告が続き、本研究は先駆的な仕事となった。また、G1期のDNA複製前の状態でのresection活性にも重要な因子の一つである CtIP の新規機能の発見にも繋がる仕事も論文発表できた。従って、未複製DNA領域におけるDSB修復過程の解明という課題において「おおむね順調に進展している」と考えられる。
CtIP の未知の機能に関する解析を進展させてresection始動後のDSB修復過程の制御機構に関する新しい知見を求める。具体的には、CtIPがフォーカス形成中に結合すると考えられるタンパク質の探索も進める。これらの解析は、本課題を推進するに当たって重要な基盤的情報をもたらすと期待される。S期の未複製領域に生じたDSB修復の過程でresectionが始動した後には大きな欠失が生じるのか、resectionの進行を抑制する機構が存在するのかを検証することが課題申請時点での目的であった。しかしその後の情報の蓄積により、G1期やS期の未複製領域のみならず、G2期細胞でresectionが進展した場合にもHRには進行しない場合があると考えられる。従って、G1やS期に限らずG2期でさえもresection始動後には大きな欠失を生じる可能性が高いと考えられるため、これを検証することに焦点を絞って研究を進める。放射線によって生じたDSBの修復の結果として生じる欠失を解析するため科研費新学術領域「ゲノム支援」の支援を申請しており、これが採択されれば全ゲノムシーケンスによる解析も実行できる。
本年度は計画よりも多くの支出があったが、初年度からの繰り越しがあったため結果的に一部が繰り越しとなった。
最終年においても新規の実験・解析等を開始する予定で、必要な器具類や新たに必要になる試薬やキット類の購入と汎用消耗品用の費用として、繰り越し分を含めて使用する計画である。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件)
Mutation Research / Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis
巻: 771 ページ: 36-44
10.1016/j.mrfmmm.2014.12.001
DNA repair
巻: 25 ページ: 72-83
10.1016/j.dnarep.2014.11.004
