| 研究課題/領域番号 |
25340053
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 関西学院大学 |
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研究代表者 |
今岡 進 関西学院大学, 理工学部, 教授 (60145795)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Ref-1 / プロテインジスルヒドイソメラーゼ(PDI) / ビスフェノールA / HIF-1alpha / 甲状腺ホルモン受容体 |
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| 研究概要 |
本研究はプロテインジスルヒドイソメラーゼ(PDI)が甲状腺ホルモン受容体(TR), 低酸素感受性因子HIF-1alphaなどの核内因子の活性をどのように制御し、代表者らが明らかにしているビスフェノールA(BPA)などの環境化学物質によるPDI活性阻害がこれらの核内因子の活性にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的とするものである。まず本年度は、PDIの酸化還元状態がどのように転写活性を制御しているかについて、in vivo, in vitroで検討した。さらに、PDI familyの一員であり、PDI 以上に強くビスフェノールA(BPA)や甲状腺ホルモン(T3)と結合することを明らかにしているERp29について結合を詳細に検討するとともに、ERp29のTR 活性への影響も検討した。HIF-1alphaはRef-1 によって還元されて活性化することが明らかになっている。大腸菌で発現・精製したヒトPDI, Ref-1についてin vitro で酸化還元状態をPEG-maleimideを用いた方法で調べた。その結果PDIを作用させたRef-1 には２個のPEG が結合し、Ref-1がPDI によって酸化され、ジスルヒド結合が形成されていることが確認できた。ヒトの培養細胞を用いて、同様の実験をしたところ、Ref-1の酸化は検出できなかったが、条件検討によってRef-1のジスルヒド結合が検出できin vivo においてもPDIによるRef-1 の酸化が証明できた。一方、BPA によるHIF-1alphaの不活性化については、そのメカニズムを検討したが、PDI-Ref-1 経由ではなさそうであり、今後の検討が必要である。一方、PDI と同様にBPA やT3 が結合するERp29 についてもPDIと同様に検討したが、TRの活性に影響を及ぼすことはなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
in vitro 実験において大腸菌で発現精製したPDI,Ref-1, HIF-1alpha, TRを用いて、それらの酸化還元状態を調べる予定であったが、大腸菌でHIf-1alpha, TRの発現精製は成功しなかった。そこで、現在は細胞中で直接的にジスルヒド結合を検出するPEG-maleimide法の条件を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでin vitroにおいて、BPAやT3がPDIと結合しその活性を阻害することやPDIがRef-1を酸化することは明らかにしているが、BPAやT3がPDIを介してHIF-1alpha, TRの活性に影響を与えているかどうかは明らかにされていない。そこで平成26年度は以下の3点について検討を行う。
1. PDIやRef-1 の活性部位すなわちシステイン（チオール基）がHIF-1alpha, TRの活性に影響を与えているかどうかを明らかにするため、PDI やRef-1のシステインをセリンに変えた変異体を作成し、培養細胞に導入しHIF-1alpha, TRの活性化及びジスルヒド形成反応を検討する。
2. BPA のPDIの結合がHIF-1alpha, TRの活性に影響を与えているかどうかを明らかにするため、BPAがPDI の基質の結合阻害によってイソメラーゼ活性を阻害していることを明らかにしているので、ジチオール-ジスルヒド変換反応に影響を及ぼしているかどうかを検討する。
3. BPA と結合するPDI family タンパク質とその相互作用因子（基質）の検索を行う。BPA 誘導体を結合したBiacoreチップを作成しているので、PDI family タンパク質を大腸菌で発現精製して、BPA との相互作用を調べる。BPAと相互作用するPDI familyタンパク質を培養細胞に過剰発現して免疫沈降し、LC/MSで相互作用因子を同定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
必要な試薬類を購入し、端数(100円未満)が生じた。
100円未満のため、次年度に必要な試薬類の購入に充てる。
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