| 研究課題/領域番号 |
25340086
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
森村 茂 熊本大学, 自然科学研究科, 准教授 (20230146)
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| 研究分担者 |
川越 保徳 熊本大学, 自然科学研究科, 教授 (00291211)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 生物機能利用 / 干潟環境 / 硫黄酸化細菌 / 脱窒菌 / 元素循環 |
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| 研究概要 |
干潟特有の自然環境が保全されている緑川河口泥質干潟底泥から、硫黄酸化細菌および脱窒菌の単離を試みた。硫黄酸化細菌については、チオ硫酸塩を硫黄源とする合成培地を用いて独立栄養型硫黄酸化細菌の単離を試みた結果、Thiomonas属と同定されたコロニーを取得することができた。しかし、単離株はpHの低下に対する感受性が高く、植え継ぎが困難であった。そこで、培地中にpH指示薬を添加することで微生物の増殖により起こる培地のpH変化を確認しながら、硫黄酸化細菌の集積培養および単離を再度行った。aprA遺伝子を標的としたコロニーPCRにより硫黄酸化細菌であることの確認を行い、16S rRNA遺伝子の塩基配列を解析した。2種類の単離株が得られ、そのうちの1種類はPseudomonas xanthomarina と同定された。この結果はThiomonas属とは異なっており、残りの１株の同定も含めて、平成26年度も継続して確認を行う。
一方、脱窒菌の単離に関しては、異なる炭素源を用いて従属栄養型の脱窒菌の単離を試みた。コハク酸を炭素源とした培地で集積培養を行い、nirS遺伝子を有していたコロニーの菌種を16S rRNA遺伝子の塩基配列から推定した結果、すべてがPseudomonas stuzeriに近縁な微生物であった。コハク酸は多くの従属栄養型脱窒菌が炭素源として利用できる物質であると報告されているが、今回用いた緑川河口干潟底泥中の脱窒菌の中ではP. stuzeriの近縁種にとって増殖に有利な炭素源であったと考えられた。トルエンを炭素源とした培地で集積培養を行ったところ、コハク酸を炭素源とした場合のような十分な増殖が見られず、炭素源無添加条件での集積培養と同様であった。しかし、炭素源無添加では得られなかったnirS遺伝子を有するコロニーが得られ、菌種の同定を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の前の研究で実施したクローン解析で主要な微生物であった、硫黄酸化細菌であるFM879003クローンおよび脱窒菌であるAzoarcusの近縁菌の特定には至らなかったが、干潟に生息する独立栄養型硫黄酸化細菌および従属栄養型脱窒菌の単離と同定を行うことができたので、おおむね順調に進展していると判断した。
平成26年度以降は、当初の計画通り、FM879003クローンの近縁菌である硫黄酸化細菌とAzoarcusの近縁菌である脱窒菌の単離と解析を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述したように研究計画に変更はない。
平成26年度は、集積培養で使用する培地の組成を変更したり、プレートの培地組成に増殖を促進する栄養源を添加する等の工夫を加えることで、目的とする株の単離を行いたいと考えている。また、平成25年度の結果では、集積培養を繰り返しても菌叢は複雑系のままで、一定方向に向かう、あるいは振動するような特定の傾向を示す変化が見られなかった。そこで、集積培養の段階で目的とする株がどのように変化しているのかを明らかにするために、各段階の集積培養で得られる微生物のクローン解析および定量PCR解析を経時的に行うことを計画している。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
最初に得られた単離株の純化が不十分で複数の細菌が混在することが判明したために、再純化に時間を費やした。そのため、２回の塩基配列解析を計画していたところが１回しか行えなかったため、塩基配列解析に関連するプラスミド抽出・制限酵素処理・塩基配列解析に関する支出が半分になり、194,329円の残額が発生した。
２回目の塩基配列解析を平成26年度早々に実施する。それ以外の主な使用計画に関しては、当初の予定通りに菌株の単離とその解析に必要となる物品の購入を中心とした支出を行う。
ただし、定量PCR解析を新たに実施するため、最初の研究計画調書に記載したサーマルサイクラーの購入を取りやめ、定量PCRに関わるキット等の消耗品購入に回したいと考えている。
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