| 研究課題/領域番号 |
25350118
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 長岡工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
田崎 裕二 長岡工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (90390434)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | キノコ / マツタケ / 香気成分 / 桂皮酸メチル / 遺伝子 / 生合成酵素 / フェニルアラニンアンモニアリアーゼ |
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| 研究概要 |
香りは食品の価値を決める重要な要素の一つである．マツタケは，その独特の香りが日本人にたいへん好まれているキノコである．しかし，マツタケの香りは保存により消失する．その原因は，収穫後の香気成分の揮発と生合成酵素の活性低下に伴う香気成分合成量の減少と考えられている．マツタケの香りを特徴づけているのは，主に桂皮酸メチルであることが分かっているが，マツタケの香りの消失に桂皮酸メチルがどこまで寄与しているのかは明らかにされていない．
平成25年度において，保存によるマツタケの香り消失と桂皮酸メチル生合成のメカニズムを解明するため，マツタケ子実体（長野産，岩手産）の各部位（傘，ひだ，柄）における桂皮酸メチル生合成酵素Pheアンモニアリアーゼ（PAL）の活性と桂皮酸メチル量の関係を調べた．その結果，長野産及び岩手産マツタケ子実体において共に，ひだでPAL活性と桂皮酸メチル含量が高く，続いて傘，柄の順であり，PAL活性と桂皮酸メチル量の間に相関関係が見出された．
また，PALをコードする2つの遺伝子（TmPAL1とTmPAL2）のcDNA及びゲノムDNAを各種PCR法で増幅した後，それらのDNA配列を決定した．次に，これらの遺伝子のマツタケ子実体（長野産，岩手産，中国産）の各部位（傘，ひだ，柄，石づき）における発現様式を調べた．その結果，TmPAL1は石づきと柄において高い発現量を示したのに対して，TmPAL2はひだと傘において高い発現量を示した．また，産地の違いによる発現量の違いは若干見られたが，発現様式は類似していた．これらの結果より，産地の違いに関わらずマツタケ子実体において，TmPAL1とTmPAL2は異なる機能を果たしている可能性が見出された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成25年度の研究実施計画①『保存したマツタケ子実体におけるPALとCCMTの酵素活性と桂皮酸メチル量の変動をみる』において，PALの活性測定の条件設定に予想以上の時間を費やしたため，CCMTの活性測定の条件設定は未着手のままとなっている．
計画②『桂皮酸メチルの原料の添加によるマツタケ菌糸体のPALとCCMTの酵素活性と桂皮酸メチル量の影響を調べる』において，マツタケ菌糸体の生育速度が遅いため，1回の培養実験において，長期時間（90日間）を有する．そのため，マツタケ菌糸体の増殖曲線の作成に時間を費やし，酵素活性及び桂皮酸メチル量の測定の進行が遅れている．
計画③『PALとCCMTのcDNAとゲノムDNAの単離と配列解読』において，植物・菌類のPALで保存されるアミノ酸配列を基に作製した縮重プライマー等を用いた各種PCR法により，マツタケのPAL遺伝子（TmPAL1）のcDNA及びゲノムDNAを増幅した後，それらのDNA配列を解読した．当初，マツタケにはPAL遺伝子が1つのみ存在していると予測していたが，2つ存在していた．そのため，2つ目のPAL遺伝子（TmPAL2）のcDNA及びゲノムDNAの増幅・DNA配列の解読を行ったことにより，CCMT遺伝子に関しては未着手のままとなっている．
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| 今後の研究の推進方策 |
保存によるマツタケの香り消失と桂皮酸メチル生合成のメカニズムを解明するため，平成26年度においては，PALとCCMT遺伝子の発現様式を明らかにする．また，PALとCCMTの桂皮酸メチル生合成に関する機能を明らかにするため，各遺伝子の組換えタンパク質を産出し，それらを精製する．これらの目的を達成するため，以下の④と⑤の研究の実施を予定している．
計画④『PALとCCMTの遺伝子の転写量測定』においては，マツタケ子実体・菌糸体の各種サンプルよりトータルRNAを抽出した後，PALとCCMTの遺伝子の転写量をリアルタイムRT-PCR法で測定する．測定試料のマツタケ子実体の傘，ひだ，柄，石づきの各部位においては，既にトータルRNAを抽出している．
計画⑤『PALとCCMTの組換えタンパク質の産出と精製』においては，既に単離した2つのPALのcDNAを用いて，大腸菌発現系pETシステムにより組換えタンパク質を産出している途中である．CCMTのcDNAを単離した後，同様の操作を行い，アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて，組換えタンパク質を精製する．
CCMT遺伝子の単離が予定より遅れているが，その他に関しては，予定より早く進行している．そのため，当初の計画は変更せず，研究を遂行する．
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