| 研究課題/領域番号 |
25350524
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
薄井 雄企 信州大学, エキゾチック・ナノカーボンの創成と応用プロジェクト拠点, 准教授 (00467169)
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| 研究分担者 |
羽二生 久夫 信州大学, 医学部, 講師 (30252050)
塚原 完 金沢医科大学, 医学部, 講師 (00529943)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 生体物性 / ナノマテリアル |
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| 研究概要 |
エンドサイトーシスの確認；既存のエンドサイトーシスはclathrin-mediated endocytosis、caveolae-mediated endocytosis、macropinocytosis、phagocytosisに大別される。我々はこれら4種類のエンドサイトーシスインヒビター（Chlorpromazine, indomethacin, 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride, cytochalasin D）と2種類のセルライン（ヒト気管支上皮細胞、ヒト悪性中皮腫細胞）でCNTの細胞内への取り込みを検討した。その結果、clathrin-mediated endocytosis、macropinocytosis、phagocytosisは取り込みの抑制が見られたが、caveolae-mediated endocytosisは抑制されなかった。
receptor-mediated endocytosisの検討；前述した既存のエンドサイトーシス阻害剤はCNTの取り込みを完全には抑制しなかった。このため、他の取り込みメカニズムの存在が示唆されることから我々がこれまでの研究で明らかにしたCNTを取り込む細胞と取り込まない細胞を用いてプロテオミクス分析した。その結果、ある1つのタンパク質（A）が候補タンパク質としてリストアップされた。一方、MC3T3-E1細胞でも石灰化処理の前後でCNTの取り込みに差があることが明らかになったため、この石灰化処理前後のMC3T3-E1細胞と別の分化状態で取り込み差があったBEAS-2B細胞のマイクロアレイ解析を行い、共通する遺伝子として（B）がリストされた。（A）はCNT以外のナノマテリアルのエンドサイトーシスに関与している可能性が報告されているタンパク質であるが、（B）は現在までのところそのような報告はない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度計画していたエンドサイトーシスの関与についてインヒビターを使った実験結果からマクロファージだけでなく、ヒトの気管支上皮細胞、さらに中皮腫細胞でもCNTはある特定の機序のエンドサイトーシスによって取り込まれることを明確に示す結果が得られた。この取り込みがラットでの腹腔内中皮腫発症に重要な役割をしていることから非常に重要な結果であると考えている。
その一方で細胞内へのCNTの取り込みが既存のエンドサイトーシスでは全てを説明できないという想定していた結果も得られたことからナノマテリアルで想定されているreceptor-mediated endocytosisの検討を行った。当初の予定通り、CNTを取り込む細胞で共通して多く発現している膜タンパク質がプロテオミクス解析とマイクロアレイ解析を行い、それぞれ１つずつ候補遺伝子として同定し、今年度の目標は概ね、達成している。現在、これらの遺伝子がCNTの取り込みに直接的に関与しているかどうかを細胞毒性と形態観察によって確認を試みている。また、当初の予定に無かったが、CNTについては情報のないCNT以外のナノマテリアルでreceptor-mediated endocytosisのレセプター候補といわれているMARCO、EGFR、ITGB1の情報を得たため、これらのmRNAの発現量をCNTの細胞内取り込み差がある分化状態の異なる細胞で定量的リアルタイムPCRを行って比較した。その結果、MACROとITGB1がCNTを取り込む状態のBEAS-2B細胞で増加傾向が確認でき、複数のreceptorの関与が示唆されている。そして、このようにして取り込まれたCNTの細胞毒性がオートファジーによるものであることも本年度の成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
CNTの細胞内の取り込みはエンドサイトーシスという言葉で説明するには余りにも複雑である。これまでの成果から少なくとも既知のclathrin-mediated endocytosis、macropinocytosis、phagocytosisが関与し、さらにこれまでの成果として細胞膜のreceptor-mediated endocytosisの関与が明らかになった。26年度はreceptor-mediated endocytosisにどのreceptorが直接、関与しているかを同定することが最重要課題である。我々が新たに候補レセプターとした2つの遺伝子と既知のナノマテリアルのレセプターを2種類のCNT取り込み細胞でsiRNA処理し、顕微鏡下での細胞内取り込みの抑制を確認するとともに、FCMによる抑制効果の定量化、さらに細胞生存率の変化で確認する。同定したレセプターについては①ナノマテリアルに特異的なのかの確認、②細胞種の取り込み差と受容体発現の相関性、③生体内での組織特異性の有無、を明らかにしていく。特に、我々のグループの研究からCNTの凝集状態と一本一本の状態とで取り込みに違いがある可能性が示されているため、NIHSが考案したTaquann法による高分散状態のCNTの取り込みがどのエンドサイトーシスによって行われるかを確認するとともに、CNTの種類や形状による取り込み差も検討する。その上でCNTの状態と各エンドサイトーシスのCNT取り込みに対する割合を幾つかの細胞で検討する予定である。
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