| 研究課題/領域番号 |
25350969
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
高山 優子 帝京大学, 理工学部, 講師 (90461467)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ヒストン / 分裂酵母 / Zinc finger / セントロメア |
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| 研究概要 |
ヒストン転写因子Ams2 のZinc fingerはヒストンプロモーター結合に必須な領域で、Zinc finger変異型Ams2はヒストン転写を活性化することができない。予備的な実験からこのZinc finger変異型Ams2は、タンパク質分解抵抗性とCENP-A機能阻害というユニークな特徴を示すことを見いだした。これらの特徴を示す分子解明を目指し、本年度は以下の解析を行った。
１、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）に別のZinc fingerを付加したキメラAms2の作成
分裂酵母Fep1はAms2同様Zinc fingerを持つ転写因子であり、結合するDNA配列が同定されている。そこで、Ams2-ZにFep1のZinc fingerを付加したキメラAms2-Zプラスミドを、ヒストンプロモーターにFep1結合DNA配列を組み込んだ細胞株を作成して導入した。キメラAms2-Zタンパク質が期待通りにFep1結合DNA配列に結合しているかを、クロマチン免疫沈降法(ChIP)解析により確認したが、残念ながらFep1結合DNA領域に結合している結果は得られなかった。そこで、①Fep1結合DNA配列のコピー数を増加させる、②LacI-LacOシステムに変更することにした。
２、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）がタンパク質分解抵抗性を示す原因を調べるために、タンパク質の分解過程のどの段階で停止しているか確認を行った。Ams2はリン酸化されることにより分解が開始することが知られているため、始めにAms2-Zがリン酸化されているかをウエスタンブロット解析によって確認した。リン酸化されたAms2は高分子側にバンドのシフトが見られるが、Ams2-Zではシフトが見られなかったことから、リン酸化されていないことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画書に示した２つの計画について、以下のように順調に進んでいる。
１、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）に別のZinc fingerを付加したキメラAms2の作成
キメラAms2-Zを持たせた分裂酵母株の作製を完了した。残念ながら、期待したDNA結合結果を得られなかったが、すでにコンストラクトの変更に着手している。
２、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）が、タンパク質の分解過程のどの段階で停止しているか
分裂酵母の染色体上のAms2遺伝子に変異を導入し、Ams2-Z型をもつ細胞株を作製した。ウエスタンブロット解析により、Ams2-Zはリン酸化されないことがわかった。この結果は、Ams2-Zはリン酸化のステップに異常があることを示している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、平成２５年度のキメラAms2-Z作成の継続実験と、Ams2-ZのCENP-A機能阻害について以下の実験を行う。
１、DNA結合型キメラAms2-Zの作成
DNA結合能を増強させる手段として①Fep1結合DNA配列のコピー数を増加させて検討する。また、②LacI-LacOシステムに変更することも平行して進める予定である。DNA結合型キメラAms2-Zが作成できたならば、キメラAms2-Zのタンパク質の分解速度の測定をシクロヘキシミド添加実験により試みる予定である。
２、Ams2-Z変異によりCENP-A発現量が変化するのか？
Ams2-Z変異がCENP-A機能阻害を示す原因には、①CENP-Aの転写を阻害している ②CENP-Aたんぱく質を不安定化させている ③CENP-Aのセントロメア局在を阻害している などの可能性が考えられる。そこで、平成２５年度に作成したAms2-Z変異株を用いて、細胞内のCENP-AのmRNA量・タンパク質量の定量を行い、野生型Ams2のそれと比較して①や②による原因かどうか判定する。①の可能性が高い場合には、CENP-Aプロモーター領域へのAms2-Zの結合をクロマチン免疫沈降法により調べる。②の可能性が高い場合には、CENP-Aタンパク質の安定性について時間経過を追って比較する。③の可能性については、GFP融合CENP-Aを発現している細胞にAms2-Z変異を導入し、GFPシグナルのセントロメア局在を蛍光顕微鏡観察により検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
消耗品で計上していた試薬類やディスポーザブル用品をキャンペーン時にまとめて購入したために、次年度に使用額が生じることとなった。
次年度の研究費使用計画は、キメラAms2-Z作成のために使用するオリゴDNAやPCR試薬、制限酵素などが必要となる。タンパク質分解速度測定時には、タンパク質合成阻害剤や細胞周期同調試薬による細胞調製後、ウエスタンブロットによる抗体や発色試薬などが必要である。CENP-A発現変化の解析では、RNA調製用試薬やRNA定量のためのラジオアイソトープやReal Time PCR関連の消耗品が必須となる。タンパク質解析には、固定薬剤や抗体、ウエスタンブロット検出試薬が必要となる。蛍光顕微鏡観察には、スライドガラス・カバーガラスなどのガラス製品や核染色試薬などが必要である。全般にわたって分裂酵母を実験材料として使用するため、酵母培養培地やシャーレ・アミノ酸類が必要となる。
本研究の進捗状況を発表し、幅広い分野の方々からご助言をいただくことが本研究推進にとって必須であるため、分子生物学会などの学会参加に伴う旅費も計上する。
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