研究課題
我々は最近、ミトコンドリアタンパク質由来の好中球を活性化する3種類の新しい生理活性ペプチド、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-CYCを生体組織より単離・精製することで同定した。さらに、ミトコンドリアタンパク質由来の断片ペプチドの中に、新規好中球活性化ペプチドが多数存在しており、好中球の挙動はこれら多数の活性化ペプチドによって制御されている可能性があることを明らかにした。そこで本研究は、さらに新規クリプタイドを同定すること、それらの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明することを目的としている。本年度の検討により、以下の研究成果が得られた。1)マイトクリプタイド情報伝達機構の解析:マイトクリプタイドとそれらの受容体との相互作用の構造的特徴を明らかにするため、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討した。その結果、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2および新たに同定したマイトクリプタイド-3において、それらペプチドが好中球を活性化する最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド配列を明らかにするとともに、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3の活性を拮抗的に阻害する複数のアンタゴニスト開発に成功した。2)マイトクリプタイドの生理的機能の解析:マイトクリプタイドの生理的機能を解析するため、既に単離・同定しているマイトクリプタイドに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。その結果、エピトープの異なる複数のマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的モノクローナル抗体の取得に成功するとともに、複数種のマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的中和抗体およびそれぞれの親タンパク質からの切断点を認識する抗体の取得に成功した。
1: 当初の計画以上に進展している
我々は最近、ミトコンドリアタンパク質に隠された好中球を活性化する3種類の新しい生理活性ペプチド、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-CYCを同定した。さらに世界に先駆けて、ミトコンドリアタンパク質配列の中に、好中球活性化能を持つペプチド配列が存在していることを示唆し、このような元のタンパク質と全く異なった生体機能を持つ断片ペプチドを総称してクリプタイドと命名している。このような研究背景を踏まえ本研究は、さらに新規クリプタイドを同定すること、それらの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明することを目的としている。本年度はマイトクリプタイドとそれらの受容体との相互作用の構造的特徴を明らかにするため、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討し、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2および新たに同定したマイトクリプタイド-3において、好中球活性化における最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド構造を明らかにすることができた。さらにマイトクリプタイドの生理的機能を明らかにするため、それらに対する特異的モノクローナル抗体の調製を試み、マイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する複数種の特異的認識抗体の取得に成功し、概ね予定通りに研究が進捗した。また本年度、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3による好中球活性化において、それらを特異的に拮抗阻害するペプチド誘導体のデザイン・合成に成功、さらにマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的中和抗体の取得にも成功し、マイトクリプタイドの生理機能を解析する上で非常に有用な武器を得ることができた。このような拮抗阻害ペプチドや特異的中和抗体を得ることは難しく、予想を超える成果をあげられた。
本研究は、我々が発見したミトコンドリアタンパク質に隠された一群の好中球活性化クリプタイド、マイトクリプタイドの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明すること、またさらに新規クリプタイドを探索・同定することを目的としている。本年度、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討した結果、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2ならびにマイトクリプタイド-3による活性化における最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド構造を明らかにすることができた。これらの情報は、マイトクリプタイド受容体同定を効率的に行うことのできるプローブペプチドのデザインに重要な知見を与えるもので、実際、受容体を効率的に同定し得るプローブペプチドのデザインにも見通しがついてきた。今後はマイトクリプタイドの受容体同定を、これらプローブペプチドと受容体を架橋することにより試みてゆく予定である。また上述したように本年度、構造活性相関を検討することにより、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3に対する拮抗阻害ペプチドのデザイン・合成に成功しているが、今後は拮抗阻害活性がより強く、酵素耐性のある拮抗阻害ペプチドをデザイン・合成してゆく予定である。さらに、取得した特異的抗体を用いて、それらのマイトクリプタイドの存在分子形態、生合成、分布および産生を検討するとともに、取得した中和抗体や拮抗阻害ペプチドによる生物活性阻害作用を用いて、個体レベルでマイトクリプタイドの生理機能および病態との関わりを解析してゆく予定である。加えて、未だ特異的抗体を取得していない様々なマイトクリプタイドに対する特異的モノクローナル抗体の調製も試みるとともに、さらに新たなマイトクリプタイドの同定も試みてゆく予定である。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 謝辞記載あり 5件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (11件) (うち招待講演 3件) 備考 (2件)
Biochemical and Biophysical Research Communications
巻: in press ページ: in press
Peptide Science
巻: 2013 ページ: 247-248
巻: 2013 ページ: 249-250
巻: 2013 ページ: 101-104
日本薬理学雑誌
巻: 144 ページ: 234-238
http://b-lab.nagahama-i-bio.ac.jp/~h_mukai/
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