改良型二次元インゲルホスファターゼアッセイの確立とホスファターゼ研究の新展開

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25350978
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 亀下 勇 香川大学, 農学部, 教授 (60127941)
• 研究分担者: 末吉 紀行 香川大学, 農学部, 准教授 (90346635)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: タンパク質リン酸化反応 / プロテインホスファターゼ / 活性制御機構 / カルモジュリンキナーゼ / ツーハイブリッドスクリーニング / 活性制御因子 / 翻訳後修飾

研究実績の概要

本研究課題は、以下の２点に焦点を絞って研究を実施してきた。（１）ホスファターゼ活性をゲル内で検出するインゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、ホスファターゼ研究に応用する。（２）CaMKホスファターゼ（CaMKP）をはじめとして様々なホスファターゼの活性制御メカニズムに関する研究を発展させる。インゲルホスファターゼアッセイ法の確立に関しては昨年度までにほぼ完了しているので、本年度は２番目の課題に取り組み以下の成果を上げることができた。
CaMKPは、多機能性CaMキナーゼを特異的に脱リン酸化してCaMキナーゼカスケードを負に制御する酵素である。このCaMKPのN末端領域にはポリリシンなどの人工的なポリカチオンが結合して、CaMKP活性を増大させることが知られていた。しかし、細胞内にこのようなポリカチオンに代わる活性化因子が存在するのか、またその正体は何かについてはこれまで不明であった。今回、大腸菌ツーハイブリッドスクリーニング法を用いて、CaMKPの結合タンパク質のスクリーニングを行ったところ、Pcdh-γC5がCaMKP結合タンパク質であることを見出した。このPcdh-γC5は、GSTプルダウン実験からCaMKPのN末端領域に結合すること、またこのタンパク質の結合によりリン酸化CaMKIの脱リン酸化を促進することを明らかにした。また、細胞内でもCaMKPとPcdh-γC5とCaMKIが３者複合体を形成し、リン酸化CaMKIの脱リン酸化を補助することが示された。これらの研究からPcdh-γC5がCaMKPとその基質であるCaMKを同時に結合することにより、内在性の "positive regulator” として機能する可能性が強く示唆された。

備考

研究室のホームページに最近の研究業績が記載されている。

研究成果

• [雑誌論文] Expression analysis of splice variants of zebrafish cyclin-dependent kinase-like 5 and its substrate, amphiphysin 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Katayama, S., Senga, Y., Oi, A., Miki, Y., Sugiyama, Y., Sueyoshi, N., Kameshita, I.
  • 雑誌名: Gene 巻: 583 ページ: 15-23
  • DOI: 10.1016/j.gene.2016.02.036
  • 査読あり
• [雑誌論文] Criticaldeterminant of substrate recognition by cyclin-dependent kinase-like 5 (2015)
  • 著者名/発表者名: Katayama, S., Sueyoshi, N., Kameshita, I.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 54 ページ: 2975-2987
  • DOI: 10.1021/bi501308k
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The phosphatase-resistant isoform of CaMKI, Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I-delta (CaMKI-delta), remains in its 'Primed' form without Ca2+-stimulation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Senga, Y., Ishida, A., Shigeri, Y., Kameshita, I., Sueyoshi, N.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 54 ページ: 3617-3630
  • DOI: 10.1021/bi5012139
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase (CaMKP/PPM1F) by protocadherin-γC5 (Pcdh-γC5). (2015)
  • 著者名/発表者名: Onouchi, T., Kishino-Kaneko, Y., Kameshita, I., Ishida, A., and Sueyoshi, N.
  • 雑誌名: Arch. Biochem. Biophys. 巻: 585 ページ: 109-120
  • DOI: 10.1016/j.abb.2015.09.014
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. (2015)
  • 著者名/発表者名: 95)Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y.
  • 雑誌名: Commun. Integr. Biol. 巻: e982405 ページ: 1-4
  • DOI: 10.4161/19420889.2014.982405
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi-PK antibody and Phos-tag SDS-PAGE (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Katayama, S., Kameshita, I., Morisawa, K. Higuchi, T., Todaka, J., Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T., Taniguchi, T., Sakamoto, S.
  • 雑誌名: MethodsX 巻: 2 ページ: 469-474
  • DOI: 10.1016/j.mex2015.11.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of calmodulin on expression of lignin-modifying Enzyme in Pleurotus ostreatus. (2015)
  • 著者名/発表者名: 1)Suetomi, T., Sakamoto, T., Tokunaga, Y., Kameyama, T., Honda, Y., Kamitsuji, H., Kameshita, I., Izumitsu, K., Suzuki, K. and Irie, T.
  • 雑誌名: Curr Genet 巻: 61 ページ: 127-140
  • DOI: 10.1007/s00294-014-0460-z
  • 査読あり
• [学会発表] 抗がん剤を処理したヒト白血病細胞HL-60の細胞内キナーゼの発現およびリン酸化動態の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉山康憲、片山将一、亀下勇、森澤啓子、樋口琢磨、戸高寛、木下英司、木下恵美子、小池透、坂本修士
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-04
• [学会発表] 担子菌Coprinopsis cinereaの成長菌糸に存在するCaMキナーゼ（CoPK02）の性質 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山下雅史、片山将一、千賀由佳子、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] Amphiphysin 1のCLAP領域はCyclin-dependent kinase-like 5によってリン酸化されるために重要である (2015)
  • 著者名/発表者名: 片山将一、大井愛海、三木洋祐、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] Protocadherin gamma subfamily C5 (Pcdh-C5)によるCaMK phosphatase (CaMKP-N/PPM1E) の分解抑制 (2015)
  • 著者名/発表者名: 小野内貴士、石田敦彦、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] CaMキナーゼホスファターゼはニューロフィラメントLと結合して重合を阻害する (2015)
  • 著者名/発表者名: 尾崎華、加藤剛志、中川綾子、石原康宏、末吉紀行、亀下勇、谷口隆信、山崎岳、石田敦彦
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-02
• [学会発表] Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYRK1A)によるCyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) のリン酸化とその意義 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大井愛海、片山将一、三木洋祐、波多野直哉、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] Ca2+/CaM-dependent protein kinase I（CaMKI）によるDistal-less homeobox 1 (Dlx1)のリン酸化とオステオカルシンの転写制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿、千賀由佳子、杉山康憲、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] CaMKIとCaMKIのホスファターゼ抵抗性に注目した活性調節機構の比較解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 千賀由佳子、石田敦彦、茂里康、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] マルチPK抗体とPhos-tagを利用した細胞内リン酸化動態の新規解析法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉山康憲、亀下勇、坂本修士
  • 学会等名: 第66回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-10-19
• [学会発表] カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIアイソフォーム（CaMKIαとCaMKIδ）の自己リン酸化に着目した比較解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿、千賀由佳子、杉山康憲、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第56回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 松江市
  • 年月日: 2015-05-30
• [学会発表] Rett症候群の発症に関わるCyclin-dependent kinase-like 5（CDKL5）のアミノ酸変異と基質リン酸化活性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大井愛海、片山将一、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第56回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 松江市
  • 年月日: 2015-05-30
• [備考] 動物機能生化学研究室
  • URL: http://www.ag.kagawa-u.ac.jp/sueyoshi/index.html