| 研究課題/領域番号 |
25400426
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
城所 俊一 長岡技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80195320)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 立体構造変化 / ２次反応 / thermolysin / savinase / 活性化エンタルピー / 反応速度定数 / カルシウム濃度 / 酵素濃度 |
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| 研究実績の概要 |
１．自己分解反応を考慮したDSCの速度論的解析方法の開発
本研究では、活性を持つ天然状態（N状態）から活性を失った変性状態（D状態）への、構造転移による１次反応が律速な過程と、自己分解反応による２次反応が律速な過程とが同時に起きる速度論的モデルに基づき、DSCデータを非線形最小２乗法で解析する方法を開発した。さらに、昇温速度やプロテアーゼ濃度を変えた複数の実験データを共通のパラメターを用いて解析するグローバル解析を実現した。２次反応速度の定量的な決定には、立体構造を持ち活性を保持している蛋白質分子の正確な評価が同時に要求される。本年度は、DSCにより直接測定される変性エンタルピーを用いた濃度補正を行うように解析方法を改訂した。これによって、本測定方法をほぼ完成し、その適用範囲を大きく広げることに成功した。
２．thermolysin等の熱変性の速度論的解析
従来は１次反応のみの熱変性モデルで解析されていたプロテアーゼthermolysinの熱変性に、２次反応が寄与していることを示すとともに、プロテアーゼ濃度を上げることで共存するカルシウム濃度や亜鉛イオン濃度によって複雑な熱変性挙動を示すことを明らかにした。中性ｐＨ、高カルシウム・亜鉛イオン濃度において、ほぼ前項で開発したモデルでDSCのプロテアーゼ濃度依存性が説明できることを示した。洗剤に使用されるプロテアーゼsavinaseの熱変性について、前項のモデルで詳細に解析し、広い酵素濃度、カルシウム濃度で前項のモデルで解析が可能であることを示した。また、カルシウム濃度依存性を解析し、２つの変性過程の遷移状態でカルシウムイオンの結合状態が評価できる可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度開発した方法でsavinaseの速度論的安定性を評価し、当初の計画以上の反応の繊維状態の詳細な議論ができることを示した。当初はそのほかの蛋白質分解酵素についても計画をしていたが、savinaseの評価をする中で解析法の改良が必要となり、今年度は解析法を改定するとともに、それを用いた溶媒条件依存性の詳細解析を行うことででほぼ順調に当初の目的を達成できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
thermolysinと阻害剤との相互作用、savinaseのカルシウム濃度依存性による速度論的安定性評価についてさらに詳細な解析を進めるとともに、これらの研究成果を公表する。また、解析法についてホームページなどで他の研究者が利用可能な形で公開することをめざす。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
解析法の開発と実験に必要な物品費が当初の予定よりも順調に進むことで節約できたことと、参加予定学会の旅費が節約できたことで当初の計画よりも初年度の研究費の支出を抑えることができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
この予算を利用して、次年度は当初予定に含まれていなかった新しい溶媒条件を含めて研究を進める予定である。
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