高感度プロテオミクスを指向したナノ構造基板による高機能バイオチップの創製

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25410151
• 研究機関: 東京工科大学
• 研究代表者: 矢野 和義 東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (40262109)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: プロテオミクス / プラズマ重合 / 分析化学 / 薄膜 / 蛍光

研究実績の概要

平成25年度においては、金属膜とプラズマ重合膜からなるナノ構造マイクロプレート上で抗体サンドイッチアッセイを試み、標的分子に対する蛍光シグナルを約10倍に増強できたことを示した。しかし特異性の評価は十分ではなかったため、平成26年度はこの点を含め、さらに別な標的分子について検討した。また分子認識素子を抗体からDNAアプタマーに代えて、同様の蛍光増強現象が見られるか評価した。
96穴マイクロプレート上に、これまでと同様な条件でAg膜と、ヘキサメチルジシロキサンをモノマーとしたプラズマ重合膜を各々最適な膜厚条件で順次製膜した。各ウェル上に一次抗体（マウス由来抗ヒトトランスフェリン抗体）を物理吸着により固定化し、トランスフェリンと相互作用させたのち、二次抗体（ヤギ由来抗ヒトトランスフェリン抗体）、引き続き蛍光標識三次抗体（Cy3標識抗ヤギIgG抗体）を相互作用させることで、高感度な抗体サンドイッチアッセイを試みた。その結果、未修飾のマイクロプレートよりもナノ積層マイクロプレートから高い蛍光シグナルを得ることができた。一方、ネガティブコントロールとして用いたウシ血清アルブミンからの蛍光シグナルも無視できないほど高かった。この理由として二次抗体または三次抗体が非特異的にブロッキング剤に結合していることが考えられたことから、今後ブロッキング剤や二次抗体、三次抗体の変更、さらに標的分子そのものの変更を検討する必要がある。
一方、ナノ構造を持ったガラス基板上にトロンビンを物理吸着させ、これにCy5標識した抗トロンビンDNAアプタマーを相互作用させることで高感度検出を試みたが、シグナルは得られなかった。これは物理吸着させたトロンビンが洗浄操作によって除去されてしまったためと考えられ、今後固定化条件を検討する必要がある。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ナノ構造を持った96穴マイクロプレートを用い、トランスフェリンを標的分子として抗体サンドイッチアッセイを行った結果、ナノ積層マイクロプレートから高い蛍光シグナルを得ることができた。一方、ネガティブコントロールからのシグナルも無視できないほど高かったが、これはサンドイッチアッセイに使用する抗体の種類が多く、ブロッキング剤との非特異的相互作用が起こったためと考えられる。これより、抗体サンドイッチアッセイにおけるナノ構造マイクロプレートの優位性は示せたものの、特異性を明確にするまでには至らなかった。
またDNAアプタマーを用いて高感度蛍光検出を試みたが、シグナルは得られなかった。これは標的分子の固定化ができていなかったためと考えられる。これよりDNAアプタマーを用いた蛍光増強現象の確認には至らなかった。

今後の研究の推進方策

抗体を用いたサンドイッチアッセイは使用する抗体が3種類と多く、ブロッキング剤との非特異的相互作用が避けられない場合もあることから、それらの組み合わせやアッセイ条件を再検討するよりも、別な標的タンパク質と抗体のセットを新たに検討する。またDNAアプタマーを用いたアッセイについては、標的タンパク質やアプタマーを確実に固相化する方法を検討する。

次年度使用額が生じた理由

様々な標的分子や抗体を用いたサンドイッチアッセイの検討が足りず、候補となるタンパク質を十分に購入していなかった。

次年度使用額の使用計画

次年度使用額と平成27年度請求額を合わせた約137万円のうち、約50万円を上記に示した新たなサンドイッチアッセイ系の確立のための標的分子や抗体の購入にあてる。また約50万円をDNAアプタマーを用いたアッセイを行うための各種蛍光標識DNA鎖などの購入に、さらに約37万円を成果発表のための日本分子生物学会（神戸）やPacifichem 2015（Hawaii）などの学会参加費にあてる。