| 研究課題/領域番号 |
25410175
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
和泉 雅之 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 講師 (80332641)
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| 研究分担者 |
梶原 康宏 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (50275020)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 不良品糖タンパク質 / ユビキチン化 / 高マンノース型糖鎖 / イソペプチド連結反応 / δ-メルカプト-L-リジン / フォールディング |
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| 研究実績の概要 |
糖タンパク質は天然型の立体構造を取ることで、生体内で酵素などとしての機能を発揮することができる。天然型の立体構造が取れなかった糖タンパク質は、不良品の目印であるユビキチンという小さなタンパク質を付加され分解除去される。本研究では、細胞がその恒常性を保つために備えている、本来の立体構造を取ることができなかった（ミスフォールドした）糖タンパク質を分解する経路を詳細に調べることを目的とし、そのプローブとしてミスフォールドしかつユビキチン修飾された分子量２万程度の糖タンパク質の初の全合成を目指している。そのための要素技術として、昨年度は、1)ユビキチンの合成に必要な３つのペプチドセグメントの合成、2)糖ポリペプチドとユビキチンとの連結に必要なδ-メルカプト-L-リジンの合成法、を確立した。本年度は、1)ユビキチン化を行うためのC-末端を活性化したユビキチン全長ポリペプチド鎖を３つのペプチドセグメントから合成した。また、2)合成したδ-メルカプト-L-リジンを組み込んだCC motif chemokine 1 (CCL1) の糖ペプチド鎖を合成し、δ-メルカプト-L-リジン部位でC-末端を活性化したユビキチン鎖との連結をおこなった。そして、3)ユビキチン修飾された高マンノース型糖鎖を持つ糖タンパク質CCL1全長糖ポリペプチド鎖の合成を達成した。今後、このユビキチン化M9-CCL1のフォールディングを検討し、CCL1部位が天然型の立体構造をもったものとミスフォールドしたものの合成を検討する。そして、CCL1部位の立体構造の解析をおこない、無細胞抽出系を用いて合成プローブが分解されていく経路を調べる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、ユビキチン修飾された不良品糖タンパク質の全長糖ポリペプチド鎖の精密化学合成をおこなった。まず、ユビキチン化に必要なC-末端が活性化されたユビキチンの化学合成をおこなった。全長76残基のユビキチンを1-27位、28-45位、46-76位の３つのペプチドに分割し、それぞれC-末端をチオエステルおよびヒドラジドとしてBocおよびFmocペプチド固相合成法により合成した。この３つのペプチドセグメントをN-末端側から順次連結し、C-末端がヒドラジドとなったユビキチン全長ポリペプチド鎖を得た。次に、糖タンパク質のユビキチン化に必要なδ-メルカプト-L-リジンを合成した。市販のラセミ体であるδ-ヒドロキシ-D,L-リジンを出発原料とし、L-アミノアシラーゼというL-アミノ酸誘導体のみを加水分解する酵素をもちいて光学分割する方法で合成した。ユビキチン化する糖タンパク質として、本研究では化学合成の報告例があるC-C motif chemokine 1 (CCL1)を選択した。タンパク質のユビキチン化は疎水性アミノ酸が周辺に多いリジンに起こりやすい傾向があるとの報告に従い、42位のリジンをユビキチン化位置として選択した。 CCL1は1-25位、26-32位、33-73位の３つのペプチドセグメントに分割し、33-73位のペプチドは42位にδ-メルカプト-L-リジンを組み込んだもの、26-32位のペプチドは29位に高マンノース型糖鎖を有する糖ペプチドチオエステルとして合成した。そして、ユビキチンC-末端ヒドラジド体をチオエステル体に変換した後、CCL1(26-73)糖ペプチドに対してイソペプチド連結反応をおこない、その後1-25位のペプチドと連結して、ユビキチン化されたM9-CCL1の全長ポリペプチド鎖を構築した。
このように、本年度はユビキチン化された糖タンパク質CCL1の全長糖ポリペプチド鎖の構築に成功したので、研究目的の達成に向けておおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、ユビキチン化された糖タンパク質CCL1の全長糖ポリペプチド鎖の構築に成功したので、今後はこれをプローブとしたユビキチン化糖タンパク質の分解経路の分析をおこなう。
本研究では、ユビキチン修飾された不良品糖タンパク質の合成を目標としている。そのため、糖タンパク質CCL1部位が天然型の立体構造とは異なるものを合成する必要がある。そこで、CCL1が３本のジスルフィド結合を有することを利用して、ジスルフィド結合を形成していないものや、ジスルフィド結合の架かり方が天然型とは違うものの合成を検討する。全長糖ポリペプチド鎖のフォールディングの際に還元剤を添加することでジスルフィド結合を形成していないもの、空気酸化条件にすることでジスルフィド結合が掛け違ったもの、またシステイン残基の側鎖をヨードアセタミドでブロックした直鎖状のものなどの合成を検討する。
こうして得たユビキチン修飾不良品糖タンパク質プローブは、無細胞抽出液に添加し、分解経路に関与する酵素群によって引き起こされる構造変化をHPLC-質量分析装置をもちいて経時的に追跡し、分解経路を探る。分解経路には大きく分けてポリユビキチン化、脱ユビキチン化、糖鎖の加水分解、タンパク質のペプチドへの断片化、の段階が想定される。無細胞抽出液には、ユビキチン化酵素群、脱ユビキチン化酵素群、最後にペプチドを分解するプロテアゾームが含まれる。その反応系にユビキチンを添加したり、プロテアゾーム阻害剤を添加するなどして、ユビキチン化不良品糖タンパク質プローブの構造変化を調べることでより詳細な分解経路が明らかにできると考えている。
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