| 研究課題/領域番号 |
25420800
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
片桐 誠之 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (00345919)
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| 研究分担者 |
入谷 英司 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60144119)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | プラスミドDNA / 精製 / アフィニティ / 膜濾過 / リガンド / 吸着 / 脱着 / 菌体破砕 |
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| 研究概要 |
近年、先天性疾患等の治療を目的として、遺伝子治療や遺伝子ワクチンの開発が活発に行われるようになり、医療品純度のプラスミドDNAを大量生産するのに適した産業レベルでの分離・精製法の開発が求められている。本研究では、スケールアップが可能なプラスミドDNAの精製法として膜濾過法に着目し、プラスミドDNAと親和性のあるリガンドを探索するとともに、リガンドと分離膜とを用いるアフィニティ膜濾過法を確立し、プラスミドDNAの精製プロセスを開発することを目的とする。プラスミドDNAと親和性のある物質として金属イオン、金属酸化物、ペプチド、タンパク質、ゲルなどをリガンドの候補とし、これらに対するプラスミドDNAの吸・脱着特性を検討したところ、酸化鉄を用いた場合に、試料液のpHを変化させるだけの容易な操作で吸・脱着が可能なことが明らかとなった。プラスミドDNAの膜濾過実験から、濾過中に形状変化が生じ、膜濾過条件の設定が難しいことが明らかとなったが、酸化鉄をリガンドとして用いると、酸化鉄に吸着したプラスミドDNAはすべて精密濾過膜で阻止され、不純物との分離が可能であった。また、濾過後に溶離液を透過させることで酸化鉄に吸着したプラスミドDNAを脱着回収できることも確認できた。実際のプロセスでは、菌体内に存在するプラスミドDNAを取り出す工程が必要となり、薬品による溶菌、超音波やビーズミルによる菌体破砕などを試み、プラスミドDNAの溶出効率を検討した。以後の精製プロセスへの影響や遺伝子治療に用いる場合の安全面も考慮する必要があり、今後、新たな菌体破砕法の導入も試み、最適な手法の確立を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究成果によりリガンドが選定され、アフィニティ膜濾過条件の検討も進みつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
順調に成果が得られているので、当初の計画に従って、次年度は「アフィニティ膜濾過条件の確立」と「プラスミドDNA精製プロセスの構築」を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度は、研究室で保管していた試料や試薬なども利用して研究を進めたため、当初の計画より低予算で成果を得ることができた。
次年度は、当初の計画内容に加えて、本年度の実施内容である「リガンドの探索」も引き続いて行い、本手法における最適なリガンドの選定を行う予定であり、本年度未使用分をこの費用にあてる。
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