| 研究課題/領域番号 |
25430003
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
細井 延武 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90543570)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ATP受容体 / グリア / 小脳 |
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| 研究実績の概要 |
脳神経系において、グリア細胞は、単なる受動的な支持細胞であり、せいぜい神経細胞を解剖学的に支持して、神経細胞の活動を補助的にサポートする程度の働きしかしていないと考えられてきた。しかしながら、グリア細胞にも神経細胞と同じような多種多様な神経伝達物質の受容体やイオンチャンネル、トランスポーター等が発現していることが最近明らかになりつつある。したがって、グリアは単なる受動的な素子ではなく、神経細胞やその他の細胞と積極的にシグナルをやり取りし、神経系の高度な情報処理に対してより直接的に関与する能動的な機能素子である可能性が大きくなってきた。小脳のバーグマングリアにもＡＴＰ受容体が存在し、神経活動に応じて活性化され、グリア内のＣａシグナル応答を引き起こすことが知られている。しかしながら、従来の薬理学的な実験では、グリアのＡＴＰ受容体のみを阻害することは困難であり、グリアに存在する多種多様なサブタイプのＡＴＰ受容体の機能的役割は明らかにされていない。そこで、本研究ではグリア特異的発現ウイルスベクターと外来性microRNAによる特異的分子ノックダウンの技術を組み合わせ、小脳バーグマングリア特異的にＡＴＰ受容体の機能を低下させることにより、グリアＡＴＰ受容体の機能的役割を検討することが目標である。緑色系の蛍光Caイメージングを妨げないよう、赤色系の発現マーカーをグリア特異的に発現するウイルスベクター（レンチウイルス、AAV）を作製した。培養したグリアを用いて、Caイメージングを行う実験系を立ち上げた。ウイルスベクターを用いてmicroRNAを導入し、ATP受容体の発現をノックダウンする手法を適用し、培養グリアを用いたATP投与に対するCa応答を指標として、効率的にATP受容体をノックダウンすることが出来るmicroRNAの配列を検討しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
緑色系の蛍光Caイメージングの波長と重ならない赤色タンパク（tdTomato、mCherry, Kusabira Orange）発現タグを組み込み、microRNAの発現を可能にするレンチウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）のコンストラクトの作製は完了した。しかしながら、培養グリアを用いたCaイメージングの実験系を立ちあげるのに手間取ってしまい、ATPに対するグリアのCa応答をようやく解析できるようになった。そのため、microRNAによるノックダウンを効率的に行う配列のスクリーニングが遅延してしまい、まだ効率的なノックダウンを行う最適な配列を見つけられていない。したがって、遅れていると自己評価し、研究期間の延長を申請した。
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| 今後の研究の推進方策 |
比較的短期間で作成できるレンチウイルスベクターを用いて、ノックダウン効率の評価を行い、microRNAの最適化を行う。特定のATP受容体のサブタイプに対して、異なる複数の配列をターゲットにしたコンストラクトを作製し、ノックダウンの最適化を行う。あるサブタイプのATP受容体に対して、最適なmicroRNAの配列が見つかり次第、マウスを用いたin vivoでの機能評価の実験を進める。In vivoでの実験において、レンチウイルスベクターでは発現が弱くてノックダウンの効率が芳しくない場合、広範囲の発現が可能で発現効率も良いAAVを用いて実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
緑色系の蛍光Caイメージングの波長と重ならない赤色タンパク（tdTomato、mCherry, Kusabira Orange）発現タグを組み込み、microRNAの発現を可能にするレンチウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）のコンストラクトの作製は完了した。しかしながら、培養グリアを用いたCaイメージングの実験系を立ちあげるのに手間取ってしまい、ATPに対するグリアのCa応答をようやく解析できるようになった。そのため、microRNAのノックダウンを効率的に行う配列のスクリーニングが遅延してしまい、まだ効率的なノックダウンを行う最適な配列を見つけられていない。したがって、遅れていると自己評価し、研究期間の延長を申請した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
microRNAを発現するレンチウイルスベクターとAAVベクターのコンストラクト作製が完了し、今後、継続して、様々なmicroRNA候補を試す必要がある。 前年度から繰越した研究費を用いて、コンストラクトの作製、およびグリア培養系でのCaイメージングに関わる試薬・消耗品等を購入する予定である。最適化されたmicroRNAの配列を用いてin vivoの実験を行う際に必要となる、電気生理学的実験や解剖学的実験等に必要な消耗品や機器なども購入する予定である。
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