| 研究課題/領域番号 |
25430032
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
杉原 泉 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (60187656)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 小脳 / プルキンエ細胞 / 神経解剖学 / 形成過程 / プロトカドヘリン10 / 下オリーブ核 / 遺伝子改変マウス / 軸索再構築 |
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| 研究概要 |
小脳の区画構造に関するこれまでの研究を発展させ、胎生期からの発達過程での区画の再編成、プルキンエ細胞の区画集団への分化、そして、区画の部位対応的軸索投射の形成に対する寄与について解析するため、以下の4つの項目の研究を進めた。
①区画標識分子の探索：区画を形成するプルキンエ細胞（PC）の亜集団によって発現の強弱が異なるマーカー分子として、プロトカドヘリン10(Pcdh10)が、E13.5から、成獣期まで使えることを確認し、さらに、それは下オリーブ核内の亜集団の認識にも有効であることが判明した。
②遺伝子改変動物の調達：諸手続きを済ませて プロトカドヘリン10の発現がLacZによって可視化されたOL-KOマウスの提供を受け、繁殖態勢を整え、このマウスのヘテロ接合体の胎仔と出生個体を実験に供する体勢が整った。胎仔および幼若個体の摘出脳標本でレポーターの発現の発達過程を追跡した。
③織学的方法：各日齢の生後幼若マウス・胎仔マウスの経心的灌流固定、脳摘出、whole-mount標本と連続切片標本作製、免疫染色法、トレーサー注入による神経標識、単一軸索再構築等の当研究室の手法をさらに改良し、新入学生2人に十分習熟させることができた。
④PC集団分布の三次元的マッピング方法の開発：連続切片における標識された細胞集団の区画を、パソコンの三次元グラフィックソフトを用いて立体的にマッピングする方法の改良を進め、2報の発表論文に用いた(Cerminara et al., 2013; Sasamura et al., 2013)。別の連続切片からの区画解析方法として、区画を細長く切り出し前後にずらしながら並べていく方法（Serial section alignment analysis, SSAA）を完成させ、1報の発表論文で用いた(Fujita et al., 2014)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
申請書に挙げた平成26年度の研究実施計画の4項目のすべてを達成することができた。さらに、本来平成26年度以降に計画されている内容も開始することができた。
その大きな理由の一つは、新たに提供を受けたOL-KOマウスが、本研究の目的に非常に良くかなっていたためである。このマウスは繁殖がやや困難であるが、レポーター分子の発現が小脳に縞模様状にくっきりと現れ、しかもその発現が、小脳発生のごく初期(E13.5)から成熟期まで続くという、本研究の目的によくかなう特性があった。このマウスを利用して、平成26年度以降に計画されていた、E13.5から成獣までのプロトカドヘリン10の発現パタンの解析をすでに開始している。
研究の進展に関する付加的な要因としては、今年度当初は予想していなかったことが、10月から大学院生が1名、大学院研究生が1名、研究グループに参加して、彼らが優秀だったことが大きかった。学生が参加したといっても、彼らの教育に時間と手間をとられるため、学生が優秀でないと研究の推進に結びつかない。それまでは、私自身と、研究室配属の学部学生とで本研究を行っていたが、優秀な研究参加者が増えた分、研究も進むようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度に本研究のために提供を受けたOL-KOマウスが、本研究の推進のために非常に有効であるということが判明したため、このことを最大限に利用して、今後本研究をおおいに推進していく予定である。
平成26年度以降の計画は、①E17.5から成獣までの小脳区画構造の発達・再編成過程の解析を行う。②発達形成過程での分析結果をふまえ、成獣での縦縞区画に関して、それの細分化やグループ化を試み、その解釈について、入出力線維の軸索投射のパタンからの検討を加える。以上の2点を提案していた。これまでの成果より、OL-KOマウスを利用して、この2点に関して当初の予定通り精密な解析を行っていくことができると考えている。
項目①の発達の進む方向に関して当初E17.5からP13までと想定していたが、OL-KOマウスを利用するとE13.5から成獣までの解析ができることが分かった。OL-KOマウスにおいて標識されるプロトカドヘリン10を発現するPC集団PC集団の配置がどのように変化し、最終的に成獣の縦縞区画を形成していくのかを系統的に調べる。プロトカドヘリン10と組み合わせる他の分子発現としては、FoxP2, PLCb4, PCP2(L7), Calbindin, EphA4, Aldoc が候補である。切片上で免疫染色やレポーター分子発現パタンからPCの集団を同定するためにH25までに完成しているSSAAの解析手法を用いる。
項目②に関しては、入出力線維の軸索投射のパタンからの検討を加えるために、アルドラーゼC発現の縞が蛍光で可視化されたAldc-vnsマウスを利用する。プロトカドヘリン10発現と関連づけられた特定の区画にトレーサーを注入して、区画特異的な軸索標識をシステマティックに行い、区画特異的な軸索投射パタンについて、機能的な立場からの、そして、発達を意識した形態学的な立場からの検討を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
必要と思われた消耗品がやや少なくて済んだため、少額の金額(4,872円)が余りました。
少額の金額であるため消耗品費として使います。
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