研究課題
哺乳類大脳皮質神経細胞は脳室帯(VZ)に直接由来するものと、脳室下帯(SVZ)での二次的な分裂を経て産生されるものがある。いずれも最終分裂を終了すると多数の突起を伸縮させて移動する多極性細胞となり、やがて脳表面側に太い先導突起、脳深部側に細いトレーリング突起を有する双極性の形態に変化して速い移動過程へと移行する。我々は皮質形成後期においては、VZに直接由来する神経細胞は、VZ内での最終分裂の後、約10時間VZ内に留まり、その後、VZの直上、SVZの下部に集積し、多極性細胞となって、さらに約24時間停留することを観察した。多極性細胞が集積するこの部位を多極性細胞集積帯（MAZ）と呼ぶ。一方、SVZでさらに分裂する集団は、早期にVZを離脱し、MAZ に留まることなく、SVZ/中間帯(IZ)内に広く分散して分裂する。両者はVZを離脱するタイミングが異なることから、前者の集団をSEP (slowly exiting population)、後者をREP (rapidly exiting population)と呼ぶ。SEPはMAZから移動を再開する時期に軸索を内側へと伸ばし、IZ下部に脳梁の線維束を作る。一方、SVZ内分裂細胞、すなわちREP に相当する細胞はヒトを含めた霊長類で著しく増加し、これらは大脳皮質の特に浅層の神経細胞を産生するとされている。これらの神経細胞は皮質の領野間を結ぶ連合繊維を形成し、複雑な情報処理を可能にしている。これらのことから、本研究課題では、SEPは脳梁の線維、REP は連合線維を形成する可能性を検討した。
2: おおむね順調に進展している
SEPとREPは細胞挙動によって同定される集団であり、両者を区別できる分子マーカーの存在は知られていなかった。本研究課題初期には未分化細胞で発現するNestinプロモーターにより、REPの同定を試みたが、このプロモーターはVZ内でも働くため、VZ由来のSEPにもラベルが入ってしまい、軸索が確立して成熟する時期まで細胞系譜を追跡することは困難であった。SEP とREPで発現が異なる分子を探索するため、SEPとREPの産生比が異なる皮質VZ内側部と外側部で遺伝子発現プロファイルを解析し、幾つかの候補分子を得ることに成功した。その内の１つはREPにおいて非常に特異的な発現が確認されたため、そのプロモーター領域を得るため、BACクローンから転写開始点付近の配列を単離した。この転写調節領域の支配下でGFPを発現するプラスミドを子宮内電気穿孔法により導入した結果、かなり正確にREPをラベルできることを確認した。子宮内電気穿孔法によるさらなる解析により、REPに特異的に発現するための転写調節領域は、遺伝子上流域のみならず下流域にも存在することが明らかとなった。しかし、電気穿孔法では導入される細胞当たりのコピー数が大きいため、Creリコンビナーゼによる系譜解析では特異性が担保されないことが問題となった。
REPに特異的に発現する候補分子の転写調節領域を同定し、その制御下でCreリコンビナーゼを発現させ、その系譜を追跡し、特に線維連絡に関して、SEPとの違いを観察する。これまで子宮内電気穿孔法により、脳内に直接、プラスミドを導入していたが、コピー数が多くなるため、本来はオフになっているべき細胞でもわずかに発現したCreがレポーターを活性化してしまうことが問題となった。そこで、子宮内電気穿孔法で十分に転写調節領域を同定した後に、その転写調節領域でCreを発現するトランスジェニックマウスを作成し、この問題を解決する。
REP特異的遺伝子の単離に成功したが、その転写調節領域が予想に反して転写開始点よりも下流にあり、その特定に時間を要した。またこれまで行ってきた子宮内電気穿孔法による遺伝子導入ではコピー数が制御できず、REP特異的遺伝子の転写調節領域を用いた正確な細胞系譜解析が困難であったため、トランスジェニックマウス作成に方針転換した。
トランスジェニックマウス作成のためのベクター作成費用が必要である。また胚操作に必要なマウスの購入費、試薬、および培養用消耗品が必要である。全て物品費として使用する予定である。
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