| 研究課題/領域番号 |
25430049
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
伊藤 美佳子 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60444402)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | デュシャンヌ型筋ジストロフィー / AAV / biglycan |
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| 研究実績の概要 |
デュシャンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、骨格筋でのdystrophin欠損による筋力低下を特徴とする進行性の遺伝性疾患である。本疾患はX染色体劣性遺伝であるが、突然変異率も高く、男児の3300人に1人の罹患率である。DMDに対する根本的な治療法はなく、進行を遅らせるための様々な取り組みがされている。
DMDにおける遺伝子治療は、モデル動物においてmini dystrophinやmicrodystrophinの導入が報告されているが、全ての筋細胞への遺伝子導入が困難なため、障壁となっている。本研究では、細胞外マトリックス分子であるbiglycanをadeno assiciated virus(AAV)を介してDMDモデルマウスmdxに遺伝子導入することを検討する。biglycanはdystrophinの機能を代償し得るutrophinの発現を誘導することが知られている。AAV-biglycanを導入したmdxマウスにおいて、運動症状の改復、筋組織での病理像の改善、遺伝子発現の変化を調べて、その治療効果を検証した。
AAV-biglycanを尾静脈より全身投与したmdxマウスは握力テストとロタロッドテストで運動症状が改善していた。mdxの骨格筋組織では、筋組織の大小不同や、中心核、細胞浸潤による炎症がみられるが、AAV治療マウスにおいて、その病理像は改善していた。現在、筋細胞中のutrophinの発現やジストログリカン複合体構成分子の発現量の変化を調査中である。今後、AAV-biglycanを導入によりutrophinの発現誘導の状況とその時期を明らかにし、さらに、コントロール群、治療マウス群の個体数を増やし、統計的に有意となる有効性を目指したい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度-26年度の計画にある、AAVベクターの大量作製と精製、rAAV-BGNのmdxマウスへの導入と運動能評価・組織学的解析を終了した。
特に、AAV-biglycanの作製には、従来の作製方法では少量のAAVしか得られなかったため、そのトラブルシューティングに時間を要した。プラスミドの純度やトランスフェクション効率、ウィルスの回収時間、塩化セシウムによる濃度勾配遠心、ムスタングによるウィルスの分離、の各ステップにおいて、AAVがどの段階で失われているかを細かく調べた。また、細胞中のAAV以外に、培地中に放出されたAAVを回収する方法についても検討した。そして、12匹のmdxマウスに導入するAAV-biglycanの作製に成功し、その後の実験に用いることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
AAV-biglycan全身治療を行ったmdxマウスとコントロールマウスにおいて、骨格筋におけるutrophin,dystrobrevin, syntrophin,nNOSのmRNA発現量を調べ、同様にタンパク発現についても変化を調査する。
mdxマウスはutorophin の発現が遅れる生後から6週齢までと筋萎縮の進行が始まる16週齢以降において正常マウスより運動能力が大きく劣ることから、5週齢でAAV-biglycan全身治療を行った後、若い10週齢と進行の進んだ24週齢においてもutorpphonやジストログリカン複合体の発現量の違いを調査し、AAV-biglycanを導入によりutrophinの発現誘導の状況とその時期を明らかにする。また、骨格筋組織切片において、biglycan,utrophin,dystrobrevin抗体を用いた免疫染色の発現量を調べ、筋組織の正常化を評価する。さらに肝機能などへの副作用調査を行い安全性を確認する。また、異所性発現の副作用の観点から筋組織特異的発現をするプロモーターhuman skeletal actin gene (HAS)下でbiglycanを発現させ、その治療効果を調査する。
また、必要に応じて、コントロール群、治療マウス群の個体数を増やし、統計的に有意となる有効性を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年9月30日まで研究を中断していたため、実験が27年度にずれ込んだため、未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験に必要な物品は、試薬、実験器具、ディスポ製品、消耗品、動物購入費、動物飼育費等である。
また、学会・研究会参加のための旅費が必要になる。
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