| 研究課題/領域番号 |
25430064
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)
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| 研究分担者 |
柿田 明美 新潟大学, 脳研究所, 教授 (80281012)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | mTOR / 蛋白合成 / 神経細胞 / 細胞サイズ |
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| 研究概要 |
実績の概要を研究計画のサブテーマごとに記載する。
１） mTORシグナルのON/OFF刺激：BDNFをコントロールとして、神経細胞におけるmTORシグナルの活性化物質を探索した。本年度は神経伝達物質を中心として調べたが、大脳皮質神経細胞においてはmTORを強く活性化する分子は無かった。現在は神経ペプチドについて検討している。OFF刺激としてはAMPKを活性化することで神経細胞のmTOR活性を著しく低下させることを見いだした。低グルコースを始め、AMPK活性化剤はBDNFによるmTOR活性化もキャンセルした。一方他の細胞系では必須であるアミノ酸の不足は神経細胞での作用は少なかった。
２） mTORによる神経細胞のサイズ変化：BDNFによる細胞サイズや突起の変化が報告されているが、mTOR阻害剤であるラパマイシンによって効果が消失したことからmTORC1を介した応答であることが示された。各種抗体を用い、免疫染色を行い面積を測定することで得られた結果である。またmTORの活性化型変異体の遺伝子導入した神経細胞では、サイズの増大が見られた。導入細胞のタイプを免疫染色で同定し、同種の神経細胞との比較を行っている。
３）蛋白合成の必要性：蛋白合成の可視化法として、SUnSET法による免疫染色の系を確立した。また上記３の結果が、mTORを介した蛋白合成の結果かを判定するためeIF4EとeIF4Gの結合を競合的に阻害する4EGIを用いて検証した。4EGIはBDNFによる蛋白合成およびサイズ増大を阻害したことから、蛋白合成の関与が明らかとなった。さらにBDNF刺激による脂質合成の亢進もmTORを介していることを新たに明らかにしたので、脂質合成とサイズ制御に関しても研究を進める。
４） 疾患脳におけるmTORシグナル：限局性皮質形成異常の貴重な手術サンプルから異常細胞および正常細胞をレーザーマイクロダイセクションで集めゲノムDNAを抽出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H25年度の研究は順調に進捗した。
当初の計画のとおり、神経細胞におけるmTORを活性化・不活性化するトリガーの探索を行った。この実験は３年間を通じて行う予定であるが、初年度として特記すべき点はAMPK活性化剤のmTOR抑制作用である。神経細胞ではアミノ酸経路よりも優位に働いていると考えられ興味深い。これに関しては論文として発表した(Ishizuka et al.,2012 J Neurochem)。神経幹細胞に関しては、iPS細胞を用いることに方向転換したため、次年度以降に持ち越しとしている。細胞サイズ制御に関しては免疫染色によってmTORシグナルの活性化度とサイズの差を計測することで、mTORによる細胞サイズの増大を確認できた。またmTOR活性化型変異体の遺伝子導入についても同様の結果が得られており、計画とおりといえる。蛋白合成に関してはピューロマイシン・抗ピューロマイシン抗体を用いたSUnSET法による免疫染色の系を確立したことによって、細胞内で蛋白合成の空間的情報を簡便に得ることができるようになった。また4EGIというmTORを介した翻訳を特異的に阻害する（と原理的には考えられる）低分子化合物を使うことにより、蛋白合成と細胞サイズ制御に関するデータを得られた。これは計画よりも一歩進んだ成果である。また研究の過程でmTORを介した脂質合成の増強という結果を得たので、細胞サイズ制御との関連について検討する予定である。疾患脳(限局性皮質形成異常)の解析については、研究計画とおり進んでおり、ゲノムDNAを収集している。
２５年度は上記の結果から原著論文１報と英文総説１報を発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
mTORシグナルのON/OFF刺激に関しては同様の実験を行う。神経幹細胞の実験系に関しては、現在iPS細胞の培養を行っているので神経分化の各過程においてmTORシグナルをON/OFFする刺激を探索する予定である。特に最終分裂の前後で、アミノ酸とグルコースの要求性がどのように変化するかなどを調べる。
mTORによるサイズ制御の実験に関してはより直接的な検証としてmTORの活性化型変異の遺伝子導入を行ってきたが、この変異を持つconditional transgenicマウスを導入（共同研究）する予定である。培養化でCreにより一部の神経細胞のみのmTORC1を活性化することによって、サイズ変化を比較検討する予定である。また免疫染色による細胞サイズの測定は２次元であるという弱点があるので、共焦点顕微鏡をもちいて３次元でのデータをとることを目指す。また同時に膜容量を電気生理学的に計測することにより、膜のマスの変化を調べる。
蛋白合成に関しては、上記のTgマウス由来の神経細胞において、4EGIによってサイズの増大が阻害されるのかを検討する。同時に脂質合成に関しては脂質合成系の転写因子（SREBP）の結合領域に対するオリゴデコイを用いた阻害を試みる。サイズ制御にとって蛋白、脂質の新規合成の意義を探りたい。
限局性皮質形成異常の体細胞変異に関しては、まず例数を増やし、ある程度サンプル数が蓄積した段階で exome解析を行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
低額の残金を有効に使うために次年度に繰り越した。
消耗品費に使用予定
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