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前年度までに、培養細胞株にマーカータンパク質GAPDH-HTの発現及びsiRNAを用いた関連タンパク質のノックダウンの併用により、シャペロン介在性オートファジー（CMA)とミクロオートファジー（mA）の活性をそれぞれ評価できる実験系を確立した。本年度はこの実験系が初代培養神経細胞でも適用可能かを検討した。初代培養神経細胞への遺伝子導入は培養細胞で用いたカチオン性リポソームを用いたプラスミドのトランスフェクションでは困難であったため、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いることにした。神経細胞に特異的に遺伝子発現させるsynapsin I promoterの下流にGAPDH-HT cDNAを導入したAAVベクターを作製し、ラット胎児大脳皮質由来の初代培養神経細胞に感染させることで、神経細胞にGAPDH-HTを高発現させることに成功した。また、siRNAは従来通りのカチオン性リポソーム試薬で導入可能であり、CMA関連タンパク質であるLAMP2A及びmA関連タンパク質であるTSG101をそれぞれ有意にノックダウンすることができた。これらのsiRNAをトランスフェクションした神経細胞において、GAPDH-HTのリソソーム/後期エンドソームへの移行をdot状の集積として観察した。それぞれのノックダウンにより、GAPDH-HTのdot状集積は部分的ながら有意に抑制されていた。さらには、CMAを活性化することが知られているmycophenolic acidを処置すると、コントロールsiRNA及びTSG101 siRNAを導入した細胞ではdot状集積は有意に増大したが、LAMP2A siRNAを導入した細胞では有意な増大は観察されれず、LAMP2AノックダウンによりmA活性が、TSG101ノックダウンによりCMA活性が神経細胞でもそれぞれ評価可能であることが明らかとなった。
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