ERストレス応答性ERGA-SNAREのAD蛋白分解とオートファジーにおける役割

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25430072
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 杏林大学
• 研究代表者: 須賀 圭 杏林大学, 医学部, 講師 (30306675)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 神経科学 / 脳・神経 / ERストレス / アルツハイマー / オートファジー / SNARE / syntaxin

研究概要

神経変性疾患の中でも特に遅発性のアルツハイマー病(AD)の発症機構や進行を調節しうる有力な分子標的の候補の一つとして、我々はAD関連蛋白質の細胞内輸送やプロセッシングを調節することを示したSyx5 (シンタキシン5)を含むER/GA-SNARE (小胞体/ゴルジ-スネア)に注目している。ER/GA-SNAREがERストレス誘導性オートファジー経路に関与し、その経路とAD関連蛋白質分解系を仲介する役割があるという仮説を検証することを目的としている。今年度はERストレス応答性ER/GA-SNAREの発現制御機構に焦点を当てて以下の解析を行った。ER/GA-SNAREの中でもまず最初に、Syx5遺伝子発現調節機構の解析を行った。ヒトSyx5ゲノム中のプロモーター領域を単離し、当該遺伝子中のERストレス誘導性転写因子が結合するコンセンサス配列を含むSyx5遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを作製した。それを発現させた細胞を用いたレポーターアッセイを行いまず定常状態でプロモーター活性を有することを確認した。次に、種々のERストレスを負荷した状態において転写活性が上昇するかを検討した。その結果、単離したプロモーター領域はそれらERストレスに応答して遺伝子の発現を上昇させることがわかった。プロモーター領域中のコンセンサス配列がその上昇に実際に寄与しているかを探るために、同配列を欠失・変異を導入したベクターを調製してレポーターアッセイを用いて調べた。結果、同配列を欠失または変異させると転写活性の上昇が消失した。神経細胞における蛋白質輸送システムを調節するSyx5が、ERストレス誘発によりその発現が上昇するシグナリングメカニズムの初期のステップの詳細を明らかにした。今後その上流の制御因子を同定することによりシグナル伝達経路を明確にした上で以降の計画としてER/GA-SNAREのERストレス誘導性オートファジー経路への関与ならびにAD蛋白質分解系への関与を検討する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ゲルシフトアッセイ(EMSA)、クロマチン沈降法(ChIP assay)を用いて応答配列に結合する転写因子を調べる実験系は現在立ち上げているところである。その系を用いてER/GA-SNARE転写活性上昇に関わる転写因子を同定できる。候補として上記応答配列に結合する転写因子群(CREB2, Luman, OASIS, BBF2H7, AIbZIP, ATF4, 5, 6α, 6β, CREB-3L3, -H) のクローニングは既に終え、それら活性型(切断後に核内で転写活性を上昇させる)発現ベクター調製と発現チェックも行っている。またERストレス負荷だけでなくオートファジーの誘導性によってもER/GA-SNAREコンポーネントの一部が発現上昇することも確認できている。さらにはオートファジー誘導時のER/GA-SNAREをライブイメージングを用いてその過程のダイナミクスを可視化する系も立ち上げの準備も始め、その系で用いるFRETの実験系について報告した(Neurosci. Lett. 2013)。それによりH26年以降後半で遂行予定の実験もあわせて準備が整ってきた。よって実験計画の達成度はおおむね順調である。

今後の研究の推進方策

H26年以降前半は、ERストレス誘発によりその発現が上昇するER/GA-SNAREの上流の制御因子を同定することによりシグナル伝達経路を明確にする。そのためにまずER/GA-SNARE転写活性の上昇に関与する応答配列に結合するERストレス誘導性転写因子を同定する。次に上流に位置するERストレスセンサーならびにシグナル伝達分子を同定してカスケードを明らかにする。その上で次のステップとしてER/GA-SNAREのERストレス誘導性オートファジー経路への関与を検証する。H26年以降後半はオートファジーを介したER/GA-SNAREのAD蛋白質分解系と生存維持機構への関与とその役割を検討する。最後にERストレスからオートファジー誘導そして神経細胞の生存維持(または細胞死)に至る一連のプロセスにおけるAD関連蛋白質の輸送と分解経路及びER/GA-SNAREの動態をタイムラプスイメージングシステムを用いてそれら過程のダイナミクスを可視化する。それによりER/GA-SNAREのオートファジー系を介したAD関連蛋白質分解への時空間的な関与を明らかにできる。以上の計画に基づく推進方策をもとに実験を遂行して総括をすることにより、それら経路のクロストークを担うER/GA-SNAREの時空間的な関与のメカニズムを明らかにし、このER/GA-SNARE分子を実質的にほぼ最下流に位置するエフェクター分子として想定できるので、二次的な副作用が少ない新規のAD治療の分子標的として格好のターゲットとして位置づけられると考えている。

次年度の研究費の使用計画

購入した消耗品の端数分であり、あらたに試薬を購入する分としては額が少ないため次年度分に持ち越したものである。
次年度分で購入予定の高額な試薬類への充当とする予定である。

研究成果

• [雑誌論文] FRET-based evaluation of Bid cleavage in a single primary cultured neuron (2013)
  • 著者名/発表者名: Harumasa Nakazawa, Akiko Nishimura, Kei Suga, Tatsuya Mishima, Tomoko Yorozu, Takehiko Iijima
  • 雑誌名: Neurosci. Lett. 巻: 536 ページ: 24-28
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2012.11.059.
  • 査読あり
• [学会発表] ER stress suppress Abeta secretion and induces the expression of ER-Golgi SNARE including Syntaxin5 proteins in neuronal cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Suga K, Saito A, Mishima T, Akagawa K
  • 学会等名: 第56回日本神経化学会大会
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20130620-20130623