| 研究実績の概要 |
小胞型神経伝達物質トランスポーターがシナプス小胞に局在するためにはトランスポーターのエンドサイトーシスが必須なステップとなる。これまでに、ムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプをレポーター分子とするクラスリン依存性エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を構築して、小胞GABAトランスポーターVGATのシグナル配列の探索を行った。その結果、N末端領域においてPhe-44を中心とする新しいタイプのエンドサイトーシス・シグナル配列を同定した。VGATの各種変異体をHEK293細胞に発現させて細胞表面発現量を解析した結果、Phe-44付近のアミノ酸配列がVGATのエンドサイトーシスに重要な役割を果たすことが分かった。また、VGATのN末端領域をHisタグあるいはGST融合タンパク質として大腸菌で大量発現・精製した。これらを用いてラット脳可溶画分のプルダウンアッセイを行った結果、クラスリン系アダプタータンパク質AP2と相互作用することを見出した。AP2はα, β2, μ2, σ2からなるヘテロ四量体であるが、バキュロウィルス-昆虫細胞発現系によるAP2各サブユニットの組換えタンパク質との相互作用を解析した結果、VGATは α/σ2複合体と特異的に結合することを見出した。VGATはPhe-44付近のシグナル配列を介してAP2と結合し、クラスリン依存的にエンドサイトーシスされると考えられる。
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