| 研究課題/領域番号 |
25430086
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
小池 亨 静岡大学, 理学(系)研究科(研究院), 講師 (20377716)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 肝前駆細胞 / Pdx-1遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究は、肝再生や肝癌発生への関与が示されている肝前駆細胞における、PDX-1転写因子の役割を明らかにする事を目的としている。そこで肝前駆細胞株を用いて、Pdx-1遺伝子の強制発現やノックダウン、ノックアウト実験を行い、培養系・細胞移植/肝障害誘導実験系を用いて肝前駆細胞の細胞特性への影響を解析するというストラテジーを取ることとした。平成25年度は、「Pdx-1遺伝子の発現を改変した肝前駆細胞株の樹立とその細胞特性の解析」という当初の研究計画に従い、以下の実験を遂行した。
1）Pdx-1強制発現プラスミドベクター、Pdx-1ノックダウンプラスミドベクター（Pdx-1 shRNA発現ベクター）、Pdx-1遺伝子ノックアウトプラスミドベクターの作製：Pdx-1強制発現プラスミドには、当初使用予定だったpIRES2-EGFPベクターによる遺伝子導入・発現効率が良くなかったため、トランスポゾンシステムを取り入れることでより効率よく遺伝子導入・発現させることができるようになった。shRNA発現には、テトラサイクリン誘導性のshRNA発現プラスミドを作製し、現在その誘導条件の検討を行っている。また、Pdx-1遺伝子のノックアウトに向けてCRISPR/Cas9システムを導入し、Pdx-1遺伝子を標的としたこれらプラスミドベクターを作製した。
2）肝前駆細胞株への遺伝子導入方法の検討：肝前駆細胞株への遺伝子導入法を検討した。これまでのところ、市販の遺伝子導入試薬を複数試みたが導入効率は極めて低かった。一方、エレクトロポレーション法、及びポリエチレンイミン法にて条件検討を行った結果、上記Pdx-1発現プラスミドベクターやコントロールのEGFP発現プラスミドベクターを導入し、薬剤選択により安定遺伝子導入株（強制発現株）を得ることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
肝前駆細胞への効率の良い遺伝子導入方法がなかなか見つからず、作製したプラスミドを用いた一過性発現による実験が行えなかった。しかし、エレクトロポレーション法、及びポリエチレンイミン法の条件検討を重ねた結果、安定導入株を得ることができるようになった。特に、トランスポゾンシステムを導入したことで安定導入株を効率よく得られるようになってきており、今後はこれら遺伝子導入システムを効果的に用いることで、作製したプラスミドを導入してノックダウン実験用やノックアウト実験用の肝前駆細胞株を作製していき遅れを取り戻したい。またあわせて、一過性発現実験も必要となってくるため、より効率のよい遺伝子導入法を探る必要があると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）平成25年度に作製したPdx-1強制発現ベクター、Pdx-1 shRNA発現ベクター、Pdx-1 ノックアウト用CRISPR/Cas9ベクターを肝前駆細胞株へ導入し、それぞれ安定導入株及びPdx-1遺伝子ノックアウト株を作製する（Pdx-1遺伝子発現改変株）。これら細胞を用いて、in vitro培養系での細胞特性（細胞増殖活性、分化誘導培養での肝細胞・胆管細胞の分化、細胞の遊走能）を解析する。また、あわせてより効率のよい遺伝子導入法を探り、一過性発現実験系でも同様の解析を行う。
2）作製したPdx-1遺伝子発現改変株を用いて、肝前駆細胞が由来した同系統のラットへの移植実験を行う。その際、ガラクトサミン投与による薬剤肝障害を誘導し、肝障害・肝再生過程における移植細胞の動態を探ることで、Pdx-1遺伝子の役割を推察する。
3）Pdx-1発現細胞が遺伝的に標識されるトランスジェニックラットを作製するための、遺伝子コンストラクトを作製する。そのためにまず、膵β細胞でのPdx-1発現制御に関して既知のプロモーター領域を含む、ラットPdx-1遺伝子上流域約11kbpをクローニングし，Pdx-1プロモーターの活性化に応じて肝前駆細胞をEGFP等のレポーター遺伝子にて遺伝的標識できるトランスジェニックコンストラクトを作製する。コンストラクトの機能検定には、肝前駆細胞株を用い、Pdx-1の発現とレポーター遺伝子の発現に相関がみられることを確認する。
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