| 研究課題/領域番号 |
25430089
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
中島 圭介 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (60260311)
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| 研究分担者 |
矢尾板 芳郎 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00166472)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | TALEN / Xenopus / knock out / genome editing / ゼノパス / ゲノム編集 / ノックアウト / oocyte |
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| 研究概要 |
本研究はTALENによるゲノム編集効率をF0世代で100%まで向上させる事を目的とする。TALENを用いた実験は受精卵にTALEN mRNAを注入する方法が一般的であるが、注入を行ったF0世代での変異導入効率は70~90%の場合が多い。大部分の遺伝子が変異導入されているとはいえ、わずかな野生型の遺伝子も残っておりこれらの働きを無視する事はできない。完全なノックアウトホモ個体を得るためにはF0同士を交配させF1を得る必要が有るが、アフリカツメガエルでは２～３年、ネッタイツメガエルでも１年の成熟期間を必要とする。F0世代で完全なノックアウトホモ個体を得るために本研究では卵母細胞にTALENを注入し、これを数日後に雌の腹腔に戻してから排卵・受精させる方法を試みた。その結果、個体の遺伝子発現が始まる前の発生段階であるstage 8において100%の変異導入効率を記録したが、それ以前の発生段階では変異導入効率の向上は見られたものの、stage 4 (8 cell)では殆ど変異が導入されていなかった。現時点でも十分な効率ではあるが、使用するTALENの活性が低ければ100%の変異導入に至らない可能性が考えられる。発生初期の変異導入効率が低い原因を調べるためにTALENとmCherryの融合タンパウ質をコードするmRNAを卵母細胞に注入し、様々なタイミングでmCherryのタンパク質の発現量をWestern blottingで調べたところ、卵母細胞では受精卵と比較してタンパク合成が殆ど行われていない事が判明した。ここまでの成果を国際シンポジウム”Frontiers in Amphibian Biology: Endangered Species Conservation and Genome Editing”で発表した。現在は卵母細胞でのタンパク合成を活性化する方法を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
卵母細胞の取り出し、ろ胞細胞の除去、TALEN mRNA注入、プロゲステロンによる卵成熟、雌の腹腔への卵母細胞の注入、排卵、受精という複雑で高度な技能を必要とする操作は全て実現した。しかし予想に反して卵母細胞でのmRNAの翻訳が極めて低いレベルであったためにTALENによる変異導入効率は期待した程のものとはならなかった。現時点でも100%の変異導入効率では有るが、活性の低いTALENでも確実に100%の変異導入を起こさせるためには更なる改良が必要であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
卵母細胞でのタンパク合成の効率を上げるためにTALEN mRNAにpoly(A)を付加するなどの工夫をし、stage 1~2 (1 cell-2 cell)で100%の変異導入効率を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
予定していたよりも使用額が少なかったため
物品費として使用する
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