| 研究課題/領域番号 |
25430095
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
亀谷 美恵 東海大学, 医学部, 准教授 (50338787)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | コモンマーモセット / HLAオーソログ / トロフォブラスト / リンパ球 |
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| 研究実績の概要 |
今年度の実績は、以下の通りである。(1) GFPマーモセット胚を野生型マーモセット母体に移植して妊娠後期のGFPマーモセット新鮮胎盤を得た。この胎盤中のトロフォブラストと野生型母体胎盤血リンパ球をGFPの発現の有無およびTrkB, CD3, CD4, CD8の発現を指標に胎仔トロフォブラストのみをセルソーターで精製する事に成功した。 昨年度、胎仔組織とされる絨毛膜組織や母体血組織とされる脱落膜中に胎仔細胞と母体細胞が混在する事が明らかと成った為、この方法の確立は非常に有用である事が明らかである。(2)昨年度までのマーモセットMHC遺伝子の同定に引き続き、GFPマーモセット胎盤組織におけるMHCの発現解析を次世代シークエンサーを用いて行った結果、胎盤のみに発現が確認され、ほとんど他の組織におけるmRNA発現が確認されないHLAオーソログであるCaja-B遺伝子を同定した。 HLA-GオーソログであるCaja-Gは、むしろ胎盤以外の組織でも高発現しており、HLA-Gと機能的に異なることが示唆された。(3)胎盤のみに発現が優位に起こるCaja-B遺伝子のcDNAおよび、beta-2 microglobulin遺伝子のcDNAを採取した。(4)マーモセットのcaja-G遺伝子に対して、抗ヒトHLA-G抗体との交差性を検討したが、特異的な反応性を示す抗体は市販品から入手できなかった。一方、Caja-Bについては、(3)で得られたcDNAからトランスフェクタントを作製し、モノクローナル抗体産生を行う為の準備を完了した。(5)マーモセットトロフォブラストとT細胞の共培養系を立ち上げる事に成功した。ここからmRNAを抽出し、共培養によるTrkB mRNA発現動態の解析が可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度までに、我々は以下の３つの系を確立している。
（１）マーモセット胎盤からのプロテアーゼ処理による絨毛膜・脱落膜・胎盤血など各種細胞の分離法を確立し、また、GFPマーモセット胚を野生型仮親子宮に移植して作製したキメラ胎盤を用いて胎盤の上記各組織中に存在する胎仔および母体細胞の識別を可能とした。また、GFPおよび各種蛍光標識抗体を用いて胎盤中のトロフォブラスト画分、ヘルパーT細胞, 細胞障害性T細胞、B細胞、NK細胞画分の精製にも成功している。これらの細胞を用いて低酸素下で共培養を行う事も可能となった。（２）重度免疫不全マウス(NOGマウス)へのヒト・マーモセット造血幹細胞移植および末梢血単核球移植を行い、ヒト細胞との比較解析を行いながら、マーモセット造血幹細胞マーカーの同定とリンパ球が分化・生着する条件、および細胞動態を解析する条件を決定した。（３）Class-I MHCに対するモノクローナル抗体作製法は、ブタSLA-１を用いてPBMC, トランスフェクタントによる免疫と細胞融合・スクリーニング法について一連の方法論を確立しており、特許申請も今年1月に行っている。
重度免疫不全マウスへの造血幹細胞移植については現在論文投稿中である。
また、マーモセットHLA-Gホモログとなる胎盤で発現が更新しているCaja-B遺伝子候補を確定し、現在コンストラクトを作製し発現確認中である。このように各種ツールが確立した為、本年度はこれらの系を用いて、発現アレイ解析等が可能になると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回までに我々は以下の３つの系を確立しているため、これらを以降の研究に用いる。
（１）マーモセット胎盤からのプロテアーゼ処理による各種細胞の分離法を確立し、GFPマーモセットを用いて母体と子供の胎盤各組織中に存在する胎仔および母体細胞の識別を可能とした。また、GFPおよび各種蛍光標識抗体を用いて胎盤中のリンパ球を含むトロフォブラスト画分、Th, Tc細胞画分の精製にも成功している。これらの細胞を用いて共培養を行う事も可能となった。（２）重度免疫不全マウス(NOG)へのマーモセット造血幹細胞移植および末梢血単核球移植を行い、マーモセットリンパ球が分化・生着する系および細胞動態を解析する系を確立した。（３）Class-I MHCに対するモノクローナル抗体作製法は、ブタSLA-１を用いてPBMC, トランスフェクタントによる免疫と細胞融合・スクリーニング法について一連の方法論を確立しており、特許申請も今年1月に行っている。
これらを用いて細胞のin vivo, in vitroでのトロフォブラストと各種リンパ球の相互作用を行い、発現遺伝子・タンパク質の解析を行う予定である。一方、現在のところ、Caja-GではなくCaja-BがHLA-Gオーソログの候補である事が明らかになったため、大きな研究計画の変更はしないが、Caja-B遺伝子に対するモノクローナル抗体産生を行うという点で計画を変更する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、mRNAの発現解析をアレイで行う予定であるが、その為の予算が本年度になった為、予算を繰り越す事になった。また、論文は現在revise中であり、これも投稿が確定してから経費がかかるため、繰り越しとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度アレイ解析、論文発表用にこの繰り越し費用を用いる予定である。
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