| 研究課題/領域番号 |
25430131
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 公益財団法人放射線影響研究所 |
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研究代表者 |
濱谷 清裕 公益財団法人放射線影響研究所, 放射線生物学/分子疫学部, 研究員 (80344414)
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| 研究分担者 |
江口 英孝 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (00260232)
伊藤 玲子 公益財団法人放射線影響研究所, 放射線生物学/分子疫学部, 副主任研究員 (30283790)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | コンディショナルトランスジェニックマウス / EML4-ALK融合遺伝子 / 甲状腺乳頭がん / 放射線 / 組織学的特徴 |
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| 研究概要 |
甲状腺組織特異的･時期特異的なコンディショナルトランスジェニックマウスを用いて、放射線甲状腺乳頭発がんにおけるEML4-ALK融合遺伝子の生物学的役割を究明するために、トランスジェニックマウスの作製に必要な導入遺伝子をCre/loxP組み換え系とテトラサイクリン発現誘導システムを用いることにより作製した。Cre/loxPの系が機能することを培養細胞を用いて確認したところ、Cre組み換え酵素によりloxPで挟んだGFP遺伝子がはずれ、その下流のEML4-ALK融合遺伝子の発現が見られたのは導入遺伝子陽性細胞の10％程度と低かった。
我々はloxPのシステムを使用せずにテトラサイクリン発現誘導システムだけを用いて、トランスジェニックマウスの作製に必要な導入遺伝子を作製した。テトラサイクリン発現誘導システムは二種類のベクターから構成されており、これらのベクターを結合させ一つのベクターに作り変えた。次に、甲状腺組織特異的な発現を可能にするために、サイトメガロウイルスプロモーターをウシサイログロブリンプロモーターに置き換えた。
ラット不死化甲状腺細胞（サイログロブリン産生細胞）およびNIH3T3線維芽細胞（サイログロブリン非産生細胞）を用いて、この発現ベクターの機能を確認した。導入遺伝子陽性の甲状腺細胞では、ドキシサイクリン存在下でEML4-ALK融合遺伝子がほぼすべての細胞で高発現されるが、ドキシサイクリン非存在下およびNIH3T3細胞では検出可能な発現は見られなかった。この発現ベクターはドキシサイクリン投与により、甲状腺組織特異的･時期特異的なEML4-ALK融合遺伝子の発現が可能であることが証明された。
骨格部分のプラスミドDNA由来の領域を除去した導入遺伝子DNAを用いて、甲状腺組織特異的･時期特異的なコンディショナルトランスジェニックマウスの作製を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Cre/loxP組み換え系とテトラサイクリン発現誘導システムを用いて作製した導入遺伝子が、きちんと機能するかどうかを培養細胞を用いて確認した。その結果、loxPが切り出されてその下流のEML4-ALK遺伝子の発現が観察された細胞は、導入遺伝子陽性細胞の10％程度低かった。したがって、この導入遺伝子をもつトランスジェニックマウスから甲状腺乳頭がんを効率よく形成させるのは難しいと予測された。
そこで、新たにloxPのシステムを使用せずにテトラサイクリン発現誘導システムだけを用いて、コンディショナルトランスジェニックマウスの作製に必要な導入遺伝子の作製を行った。このため、導入遺伝子の完成に予定以上の時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
1．ドキシサイクリン投与後、甲状腺乳頭がん形成までの時間と発生効率を決定する。腫瘍発生までの時間経過に伴う甲状腺組織の形態学的変化、および発生した甲状腺乳頭がんの組織学的特徴について調べる。また、甲状腺乳頭がんの発生および進展に対するALK遺伝子の下流シグナル経路の阻害剤の影響を調べる。
2．放射線被曝が甲状腺乳頭がんの生成に要する時間およびEML4-ALK誘発甲状腺乳頭がんの悪性度あるいはそのいずれかに影響を及ぼすのかどうかを明らかにするために、コンディショナルトランスジェニックマウスにおける甲状腺乳頭がんの発生に要する時間ならびに時間経過に伴う甲状腺組織の形態学的変化、および発生した甲状腺乳頭がんの組織学的特徴を照射および非照射マウス間で比較検討する。また、マイクロアレイ分析を用いて、甲状腺乳頭がんにおける遺伝子発現プロファイルを照射および非照射コンディショナルトランスジェニックマウス間で比較検討する。
3．被爆者の甲状腺乳頭がんに見出されたEML4-ALK融合遺伝子が放射線被曝と強く関連することをより明確にするために、in vitroの実験系を用いてEML4-ALK融合遺伝子がヒト不死化甲状腺細胞に誘発されるかどうかを調べる実験計画を新たに加える。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
コンディショナルトランスジェニックマウスの作製が遅れたため、その作製にかかる費用ならびにトランスジェニックマウスを用いた発がん実験において使用する予定であった種々の抗体の費用が平成26年度に持ち越されたため。
トランスジェニックマウスの作製と系統保存のための凍結胚作製および甲状腺の分化マーカーに対する抗体の購入に充てる。さらに、トランスジェニックマウスに形成された甲状腺乳頭がんのマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析に使用する。
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