| 研究課題/領域番号 |
25430140
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
高 ひかり 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60338374)
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| 研究分担者 |
藤村 務 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70245778)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 膀胱がん / 早期発見・診断 / 尿中腫瘍マーカー / 糖鎖修飾ペプチド / ELISA / ウエスタンブロット |
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| 研究実績の概要 |
「研究の目的」
泌尿器系がんのなかでも膀胱がんは、前立腺がんにおけるPSAのような有効なスクリーニングマーカーがないことなどから、現在のところ一般人口を対象とした検診スクリーニングは施行されていない。しかし、膀胱がんの予後は依然として悪く早期発見・診断が強く望まれる。申請者は、膀胱がんの早期発見につながる患者への負担が少ない尿中腫瘍マーカーの探索を行った結果、候補と成り得る糖タンパク質を見つけた。糖タンパク質の性質を詳細に調べると共に糖鎖修飾ペプチドを抗原とする抗体を作製し、膀胱がんの早期発見・診断につながる尿中腫瘍マーカーとしての有効性を評価する。
「研究実施」
Glycopeptide抗体の評価：「1.ウサギで作製した抗体の評価」前年度に作成した抗体の特異性と感度を評価した。ウエスタンブロット法で評価した結果、膀胱がん患者の悪性度のGradeが進行する程に、抗体で染色される割合が増加した。特に、75kDaの糖タンパク質 X由来の抗体で顕著であった。膀胱がん患者由来の尿と健常人由来の尿を優位に区別することが可能であった。しかし、50kDaの糖タンパク質 Y由来の抗体はGrade 1と2の間であまり差がなく、Grade 3まで進まないと差が見られなかった。現在、抗体の精製度を上げ、特異性と優位性を評価中である。尿10ul中の糖鎖タンパク質 X or Yを検出可能であることから、十分な感度が得られた。「2.マウスで作製した抗体の評価」ウエスタンブロット法で評価した結果、75kDaの糖タンパク質 X由来の抗体の特異性は、ウサギの抗体より高い傾向を示したが、感度が不十分であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膀胱がん患者(Grade 3以上) 及び健常人由来の尿から糖タンパク質X及びYを免疫沈降及びゲル濾過法を用いて精製し、目的の抗原 Glycopeptideを精製できた。ウサギで作成した75kDaの糖タンパク質 X由来の抗体は膀胱がん患者の悪性度のGradeが進行する程に、抗体で染色される割合が増加し、また、健常人と優位に区別することが可能であった。また、尿10ul中の糖鎖タンパク質 X or Yを検出可能であることから、十分な感度が得られている。50kDaの糖タンパク質 Y由来の抗体はGrade 1と2の間であまり差がなく、Grade 3まで進まないと差が見られなかったが、作製した抗体の精製度を上げる（純度を良くする）ことにより十分解決可能と考えている。ELISA法を構築する上で、ウサギあるいはマウスで作製した抗体のどちらがより有効で実用的であるか、現在、検討を重ねているところである。また、実用的なELISA法にする為に測定可能なプロトコールや反応条件の最適化も検討している。今回作製した抗体は、一般的なペプチドあるいはタンパク質に対する抗体と違い、糖鎖修飾を含むペプチド構造全体を認識するのが特徴的であり、がん特異的な糖鎖修飾ペプチド配列を認識している。研究全体としておおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
「糖鎖修飾ペプチド抗体の特異性の評価」作製した抗体をダイレクトあるいはサンドイッチELISA法により健常者とがん患者由来の尿を比較し、特異性と感度の評価を行う。膀胱がん患者の早期診断への実用性を評価する。「多項目同時測定システムの開発」糖タンパク質X及びYのタンパク質に対する抗体（市販品）と作製したGlycopeptide抗体を用いた多項目同時測定系の構築を試みる。一次抗体に市販品の抗体X及びYを用い尿中のタンパク質X及びYをキャプチャーする。二次抗体としてビオチン標識糖鎖修飾（Glycopeptide X及びGlycopeptide Y）抗体を結合さストレプトアビジン-フィコエリスリン(PE)で蛍光ラベルする。この方法により、尿中の糖タンパク質X及びYの糖鎖修飾（Glycopeptide）量を同時に測定することが可能となる、従来のELISA法に比べ試料量や測定時間が短縮され低コストであり、スループットの大幅な向上を実現できる。多項目の分析結果を多角的に評価することにより検出感度及び特異性の向上が期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を申請するに当たり計上した研究費については、消耗品を主体とした経費が大部分を占める。1)抗体作製及び精製に必要な酵素、試薬、カラム、チップ、器具、動物、飼育代その他。2)抗体確認の為のウエスタンブロット関連試。3)ELISA法の系を構築するための測定試薬。4) LUMINEX測定用関連試薬、ビーズ、蛍光色素、結合試薬など一般試薬、器具類。旅費については国内学会に年１～２回の発表分を算定している。国際学会については年１回分を算定している。論文の投稿に必要な英文校閲費、投稿費用等を予定している。
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| 次年度使用額の使用計画 |
1)抗体作製及び精製に必要な酵素、試薬、カラム、チップ、器具、動物、飼育代、その他とし30万円。2)抗体確認の為のウエスタンブロット関連試として10万円。3)ELISA法の系を構築するための測定試薬、LUMINEX測定用関連試薬、ビーズ、蛍光色素、結合試薬など一般試薬、器具類として35万円。旅費については国内、国際学会合わせて20万円、文の投稿に必要な英文校閲費、投稿費用等には10万円を予定している。
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