| 研究課題/領域番号 |
25430156
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
|---|
研究代表者 |
堀内 大 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (30608906)
|
|---|
| 研究分担者 |
小林 信春 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10150616)
赤塚 俊隆 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (30159321)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 抗腫瘍ワクチン / TERT / リポソーム / CTL |
|---|
| 研究概要 |
平成25年度では、まず、TERTアミノ酸配列をBIMASにより解析し、HLA-A2またはHLA-A24結合モチーフを持ち、ヒトTERT（hTERT）とマウスTERT（mTERT）で共通のアミノ酸配列を持つペプチドをBIMAS scoreの高い順からHLA-A2で10種類、HLA-A24で７種類選定した。本年度はHLA-A2に結合する合成ペプチドを作製した(native peptide: NP)。また、HLA-A2拘束性エピトープペプチドの免疫原性を高める目的でヘテロクリティックペプチドをそれぞれ1種類ずつ合成した(heteroclitic peptide: HP)。
以上の20種類のHLA-A2拘束性エピトープペプチドから免疫原性の高いものを選定する目的で、ペプチドをリポソーム表面に結合してHLA-A2トランスジェニックマウス（HHDマウス）の皮下に免疫した。それらのマウスから脾リンパ球を分離し、抗原特異的に誘導されるIFN-gamma陽性CD107a陽性CD8リンパ球数をフローサイトメトリーで測定した。その結果、免疫原性の高いペプチドをNPで3種類、HPで3種類同定できた。
これらのペプチドに特異的なCTLの抗腫瘍活性を検討するために、ペプチド表面結合リポソームで皮下免疫したHHDマウスの脾リンパ球を分離し、当該ペプチドで6日間in vitro刺激を行った後、HLA-A2を発現するマウス腫瘍細胞であるRMA-HHDとin vitro刺激後のリンパ球を反応させ、リンパ球のIFN-gamma産生性と細胞傷害活性を測定した。その結果より、リポソーム表面に結合し免疫することでHLA-A2陽性腫瘍細胞に対して大変強く反応するCTLを誘導できるエピトープペプチドがNPで2種類、HPで2種類同定できた。また、HPによる免疫で誘導されたCTLはNPも認識する交差反応性も確認できた。
以上の結果は本研究遂行の骨格となる重要な結果であり、抗原表面結合リポソームが有効な抗腫瘍ワクチンとなりうる可能性を示唆した大変意義のあるものと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画では、平成25年度において、リポソーム表面結合に適したTERT由来エピトープペプチドを同定し、それを用いた抗原表面結合リポソームワクチンを作製し、in vitro実験を行うことであった。本研究により同定されたTERTエピトープは今まで報告の無い新規エピトープであった。これらのエピトープは、既に報告されているエピトープと比較してBIMAS scoreが低く、通常状態では免疫系に認識されていないcripticな状態にある可能性が考えられ、表面結合リポソームワクチンにより免疫寛容未成立なTERTエピトープに対するCTL反応を引き起こすことを目的とした本研究に合致したエピトープを同定できた可能性が高いと考えられた
当初の計画ではHLA-A2とHLA-A24の２つのHLA型について検討する予定であったが、本年度は本研究の実行に十分なHLA-A24トランスジェニックマウスの個体数が確保できず、HLA-A24についての検討は次年度への持ち越しとし、本年度の研究の標的をHLA-A2に絞り、当初の計画には無かったヘテロクリティック改変ペプチドの利用をHLA-A2拘束性ワクチンの効果を高める工夫として加えた。ヘテロクリティックペプチドにより免疫で誘導されたCTL反応は非改変ペプチドで誘導されたCTL反応よりも強く、この工夫によりcripticエピトープに対する免疫誘導効率が高められる可能性が示唆された。
現時点ではHLA-A24の研究実施に関しては予定より遅れているが、HLA-A2の研究により研究遂行の基本工程は確立され、HLA-A2エピトープによるワクチンはヘテロクリティックペプチドの利用などにより当初の計画を越える進展があった。以上より本研究は概ね順調に進展していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
HHDマウスを使って、腫瘍の移植実験を行う。具体的には平成25年度に同定したエピトープペプチドを表面結合した抗原表面結合リポソームで免疫したマウスに RMA-HHD腫瘍細胞を移植し、抗腫瘍効果を検討する。
また、平成25年度の実験で反応が見られたエピトープはTERTアミノ酸配列の中で比較的近い位置に存在することから、数種類の同定エピトープを含むロングペプチドを合成し、ロングペプチドを表面結合した抗原表面結合リポソームの免疫誘導効果および抗腫瘍効果についても検討する。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の計画では平成25年度はHLA-A2とHLA-A24の２つのHLA型について検討する予定であったが、本年度は本研究の実行に十分なHLA-A24トランスジェニックマウスの個体数が確保できず、HLA-A24についての検討は次年度への持ち越しとし、HLA-A2に対するワクチンのみ検討を行ったため、次年度使用額が生じた。
平成26年度はHLA-A24に対する実験を行い、当該の次年度使用研究費はこの実験経費に使われる。平成26年度はHLA-A24のin vitro実験に加えて、大がかりにin vivo実験を行うため多数のマウスを繁殖・維持するための費用が必要である。また、平成26年度も抗原ペプチドの合成費用や、CTL反応の解析のためのラベル抗体などの試薬や実験器具を購入する費用が必要である。さらに、国内学会に参加するため、国内旅費費用に研究費を使用する。
|
