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2014 年度 実施状況報告書

新規なPCNAアンロード機構による細胞周期制御とゲノム維持

研究課題

研究課題/領域番号 25430171
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

塩見 泰史  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (80380567)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワードPCNA / Elg1-RFC / PCNAローダー / PCNAアンローダー / 細胞周期 / ゲノム維持
研究実績の概要

前年度には、RNAi法等によるヒト細胞内での解析で、Elg1-RFCがPCNAアンローダーとして機能していることを明らかにした。当該年度では、Elg1-RFCの細胞内における動態と、精製タンパク質を用いた生化学的解析によりその特性を明らかにすることを目的とした。
細胞内動態については、Elg1-RFCと、PCNAローダーとして機能する他のRFC複合体(RFC1-RFC、Ctf18-RFC)との比較を行った。その結果、Elg1-RFCは他のRFC複合体が溶出する高塩濃度でもクロマチンに結合しており、これはアンローダーとして機能するための特性の1つと考えられた。また、RFC1-RFCやCtf18-RFCはS期細胞においてPCNAと共局在することが示されているが、Elg1-RFCについては、これらとは全く異なる挙動を示した。今後は、これら新しく見いだしたElg1-RFCの動態について、その意義を含めて検討したい。
生化学解析については、組換え精製複合体を得るために当初の目的通りに昆虫細胞発現系での発現と精製を行った。しかし、Elg1は他のRFC複合体とは異なり、昆虫細胞内では非常に分解されやすいことが分かった。そこで、ヒト細胞発現系(Uno et al., Methods, 2012)からの精製に切り替え、発現コンストラクトの構築と、ヒト細胞内での発現チェックをおこなった。その結果、昆虫細胞に比べElg1の安定性が格段に改善された。そこで、パイロット実験としてスモールスケールで精製を行い、複合体を得ることができる精製条件を確立した。これまでに、Elg1-RFCの精製複合体を用いた解析例は報告されていない。そこで現在は、ラージスケールでの精製に取り組んでおり、精製が完了次第、PCNAロード、アンロード活性等の生化学的解析を行い、Elg1-RFCの特性を明らかにしていく予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Elg1-RFCの精製が当初の予定より遅れたことによる。これは、Elg1が昆虫細胞発現系では非常に不安定であったためである。しかし、ヒト細胞発現系に切り替えることで、Elg1が安定に発現するように改善され、精製のパイロット実験までは実施することができた。
一方、精製Elg1-RFCによる生化学解析に用いるための鋳型DNAとしては、ssDNAを調製し、ビオチンを付加したプライマーから合成によってdsDNAにし、ニッケースやライゲースによってニックの有無をコントロールできる環状DNAをすでに調製済みである。これを用いることで、PCNAロード、アンンロードがどのようなDNA構造特異的に行われるのかといった特性を解析していく準備は整っている。

今後の研究の推進方策

当初の予定よりElg1-RFCの精製が遅れたものの、すでに改善は行うことができたので、Elg1-RFCの特性について生化学的な解析を行い、他の複合体との比較でRFC複合体ファミリー間の機能の普遍性や特異性を明らかにしていく。
また現在は、Elg1-RFC複合体の細胞内動態の解析の一部として、当初の研究計画にはなかった細胞内での相互作用タンパク質の質量分析の準備も行っており、この計画も進めていくことでElg1-RFCのPCNAアンローダーとしての特異性を明らかにしていく予定である。

次年度使用額が生じた理由

研究費用の一部は講座費から支出することができたことと、当該年度に予定していた海外出張を次年度に行うこととしたので、次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

海外での国際学会への参加と、新規の物品購入のために使用する。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Mitotic UV Irradiation Induces a DNA Replication-Licensing Defect that Potentiates G1 Arrest Response.2015

    • 著者名/発表者名
      Morino M, Nukina K, Sakaguchi H, Maeda T, Takahara M, Shiomi Y, Nishitani H.
    • 雑誌名

      PLoS One.

      巻: 10 ページ: -

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0120553.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] PCNAアンローダー、Elg1-RFCの機能解析2014

    • 著者名/発表者名
      塩見泰史、西谷秀男
    • 学会等名
      第37回 日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜、神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] S期クロマチン特異的なタンパク質分解系CRL4-Cdt2の制御機構2014

    • 著者名/発表者名
      林晃世、塩見泰史、高橋達郎、末永尚弘、西谷秀男
    • 学会等名
      第37回 日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜、神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] 紫外線DNA損傷時におけるCdt1分解の解析2014

    • 著者名/発表者名
      田中美如、高原教代、塩見泰史、西谷秀男
    • 学会等名
      第37回 日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜、神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [備考] 兵庫県立大学大学院 生命理学研究科 生体情報学II研究室 HP

    • URL

      http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/biosig/japanese/Top.html

URL: 

公開日: 2016-05-27  

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