研究課題
大腸菌ゲノムの転写パターンの決定と環境変動に応じた制御を解明する目的で、7種類のシグマ因子と約300種の転写因子の全てに関して、制御標的遺伝子セットを同定し、その基盤で『ひとつの生物のすべての転写因子の制御機能解明』する目標で研究を継続し、以下の成果を得た。（１）全シグマ因子、全転写因子の支配下制御標的遺伝子の同定：大腸菌全７種類、全300種類の転写因子を大量発現し、単離精製に成功した。純化蛋白を利用し、それぞれの認識結合遺伝子DNAを、新規に開発したGenomic SELEX法を利用して探索した。本年度、全シグマ因子、転写因子約200種に関して、支配下遺伝子セットを同定することに成功した。（２）特定遺伝子の転写制御に関わる全シグマ因子、全転写因子の同定：特定遺伝子の転写制御に関わる全因子を同定するPS-TF (promoter-specific transcription factor)探索法を開発した。純化転写制御因子コレクションを利用し、目的遺伝子プロモータ－に結合する転写因子群を同定した。大腸菌の生存様式決定に重要な役割を果たす遺伝子群（良好環境で単独遊泳生存状態形成の重要因子FlhDC、過酷状況で集団生存を諮るバイフィルム形成鍵因子CsgD、細胞分裂装置遺伝子群の制御因子SdiAなど）の転写制御に関わる転写因子群の同定に成功した。（３）全シグマ因子、全転写因子の細胞内濃度の計測と機能制御機構の解析；ゲノム制御の提案モデルでは、転写制御因子群の活性成分の細胞内濃度が、重要な役割を果たす。そこで、各制御因子の特異抗体を作製し、免疫定量法で、大腸菌細胞内の濃度の計測を実施した。加えて、転写因子の活性制御に関わるエフェクターの系統的探索及びリン酸化など、蛋白修飾による活性制御の系統的解析を実施した。これらを総合して、本年度も、目的とする『ひとつの生物のすべての転写因子の制御機能解明』に向けて、更に着実に前進出来た。
1: 当初の計画以上に進展している
大腸菌RNAポリメラーゼに作用し、その転写特異性の変換に関わる、２群の転写制御因子（７種類シグマ因子と300種類転写因子）を、遺伝子クルーンから大量発現系を構築し、純化精製した。純化蛋白を利用し、独自に開発したGenomic SELEX法を利用して、それぞれの制御標的遺伝子群を探索した。制御支配下遺伝子群については、標的対象遺伝子については、個別に細胞内での制御を解析した。解析作業量は、制御標的遺伝子数量に相関するが、このプロジェクトに加わって来た、国内外の共同研究者の協力で、順調に進んで来た。研究成果は、論文として公表する作業も平行して行い、2014年度では、10編以上の論文を公表することが出来た。論文公表に加えて、解明した大量の転写制御因子の制御機能については、データベースを構築し、広く当該分野に公開し、情報を利用できるシステムを構築する目的で、国立遺伝学研究所の協力を得て、新たなデータベースTEC（Transcription Profiling of Escherichia coli）の準備を開始した。
ゲノム制御の全体像を解明する目標の二つの柱の研究（大腸菌全７種類シグマ因子、全300種類転写因子のGenomic SELEXを利用した制御標的の探索同定、大腸菌の生存様式の決定や多種多様な環境ストレス応答の主要遺伝子プロモーターに作用する転写因子群のPS-TF法による探査同定）を最終年度で完成させ、『ひとつの生物のすべての転写因子の制御機能解明』を達成したい。研究完成に伴い、この間の研究で得られた成果情報を広く利用できるTEC（Transcription Profiling of Escherichia coli）データベースの構築を進め、公開をしたい。更に、本研究で構築した多種多様の研究資材は、今後、原核生物の研究を大規模に集団で展開できる研究室の構築が困難な時代に入るであろうから、資材保管利用システムの構築も計画したい。細菌研究は、病原性解明を始め保健医学の重要な基礎分野であり、また食糧生産、環境浄化などでも極めて重要な学問分野であるので、これらのデータベースや、資材共有システムは、重要な貢献をするに違いない。
発表論文の発表時期が次年度になったので、論文掲載料の支払が次年度となった。
発表論文掲載料支払に充当する予定。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (13件) (うち査読あり 13件、 オープンアクセス 12件、 謝辞記載あり 13件) 学会発表 (11件) 図書 (1件)
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