| 研究課題/領域番号 |
25440002
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
牛田 千里 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50250593)
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| 研究分担者 |
武藤 あきら 弘前大学, 農学生命科学部, 研究員 (80034635)
姫野 俵太 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (80208785)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 受精異常 / 精子形成 / 胚発生 / 卵形成 / 減数分裂 / 核小体RNA / 線虫 |
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| 研究概要 |
本研究では精子形成異常を示す線虫の新規変異株MT16939について，その原因遺伝子を同定し，その遺伝子の変異がなぜ精子形成異常を引き起こすのか明らかにすることを目的とする。平成25年度はMT16939の精子形成異常の詳細を把握すること，原因遺伝子候補の発現を明らかにすること，原因遺伝子を特定するためのレスキュー実験を開始することを目指して計画した実験を行った。その結果，MT16939では成熟した精子が形成されていないこと，野生株N2の成虫では見られない特徴的な細胞が高頻度に存在すること，その細胞はおそらく精細胞であることが示された。このことからMT16939の精子形成は精細胞から精子に発生が進む過程で停止していることが示唆された。さらに，MT16939の変異をヘテロで保持させた虫の卵は100細胞期のあたりで胚発生を停止させるという新たな知見も得た。MT16939は機能未知のタンパク質遺伝子T26A8.2およびT26A8.4を部分的に欠損している。両遺伝子の発現をqRT-PCRにより解析し，MT16939とN2で比較すると，前者は上昇し，後者は低下していた。また，T26A8.4の下流にコードされている核小体低分子RNA遺伝子cer-2aはMT16939のゲノムから完全に欠失しており，発現は検出されなかった。MT16939の精子形成異常はこれら３つの遺伝子の変異のいずれか，あるいはその中の２つまたはすべてに欠損を生じた結果である。これまでにcer-2aの導入によるMT16939の表現型の回復を調べたが，受精卵の排出や成熟した精子の形成はみられなかった。したがってcer-2aのみが精子形成に携わっている可能性は低い。今後T26A8.2およびT26A8.4，あるいはそれぞれを組み合わせたDNAコンストラクトをMT16939に導入することで原因遺伝子を特定することができると期待する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究開始時にはMT16939の精子形成が減数第一分裂のディプロテン期とディアキネシス期の間で止まっていると予想していたが，その後の実験でMT16939の精子形成異常が精細胞から精子になる段階で起こっていることを示唆するデータを得たこと，レスキュー実験を開始し，精子形成異常の原因遺伝子候補３つのうちcer-2aのみがその原因である可能性の低いことを示すデータを得たことは，当初の仮説や研究計画を修正しつつ研究がおおむね順調に進んでいることを示す。また，MT16939の変異がヘテロで存在した場合に胚発生が100細胞期あたりで停止するという新たな知見は，T26A8.2，cer-2a，T26A8.4のいずれかもしくは複数が初期胚発生に関与することを示唆するものであり，本研究が動物の初期胚発生における新たな遺伝子ネットワークの発見につながるものと期待される。この点においても本研究をおおむね順調に進んでいるものと評する。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はまず原因遺伝子を特定することを第一にT26A8.4やT26A8.2のレスキュー実験を中心として研究を進める。原因遺伝子が特定できた段階で，今度はその遺伝子の機能を明らかにするため，それが発生過程のどの時期にどの細胞で発現しているか，また，その局在はどこであるか，ノザンブロッティング，ウェスタンブロッティング，in situハイブリダイゼーション，免疫染色法を用いて明らかにする。次に，原因遺伝子に関する遺伝学的解析を行う。原因遺伝子の変異株を用意し，MT16939と同様の表現型を示すことを確認した上で，この変異体と，これまでに単離されている他の精子形成異常を示す各種変異体とを交配させて，原因遺伝子と関係する他の遺伝子や，原因遺伝子が精子形成過程において関与する経路を明らかにする。また，原因遺伝子の変異体について，マイクロアレイ解析およびプロテオーム解析を行い，野性株N2に比べて発現の変動を示す遺伝子を同定し，原因遺伝子との関係について検討する。一方で，原因遺伝子の産物に関する生化学的な解析も進め，関連因子の単離，同定を行う。まず，原因遺伝子産物が形成する複合体の大きさや，それを単離するための条件を，ショ糖あるいはグリセロール濃度勾配遠心法とウェスタンブロッティング，ノザンブロッティングを組み合わせて，もしくは免疫沈降法，カラムクロマトグラフィーを用いて解析する。その後，原因遺伝子産物の複合体に含まれる因子を単離し，質量分析法等により，その因子を同定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
試薬などをメーカーのキャンペーンの時期に購入するなどにより，当初の予定していた費用を節約することができた。
前年度からの繰越しは消耗品と謝金にあてる予定である。
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