ポリADPリボシル化酵素PARPによる熱ショック因子HSF1の転写制御機構

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25440010
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 藤本 充章 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80359900)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: HSF1 / PARP / 転写 / ポリADPリボシル化

研究概要

細胞が高温にさらされると、プロテオスタシス容量の調節を担う熱ショック蛋白質等の発現が誘導される。この応答は熱ショック応答と呼ばれ、主に熱ショック因子(HSF)によって転写レベルで制御される。しかしながら、熱ショックによるHSF1の活性化やクロマチン構造の調節などの一連の転写調節機構については未解明な部分が多い。今回、新たにHSF1結合蛋白質としてポリADPリボシル化酵素を同定し、その機能解析を行った。
高等動物のPARPは17 種類も存在し、ヒストンや転写因子をポリADPリボシル化して転写調節をおこなう。まず、HSF1と相互作用するPARPを免疫沈降法により探索し、PARP1とPARP13がHSF1と相互作用することを明らかにした。次に、マウス胎児線維芽細胞や各種のヒトがん細胞のPARP1あるいはPARP13をノックダウンすると、熱ストレスによるHSP70 mRNAの発現誘導が顕著に減弱した。PARP1とPARP13は、ともに非ストレス条件下ではHSP70プロモーターに結合するとともに熱ストレスによりプロモーターから遊離する。同時に、PARP1の結合のみが下流のHSP70遺伝子領域へ移動する。クロマチン免疫沈降法によってHSP70プロモーターへの複合体形成の解析を行ったところ、PARP1のリクルートには、HSF1とPARP1の直接の結合が必要であった。驚いたことに、PARP1のリクルートには、PARP13とも直接結合することが必要であった。さらに、熱ストレスによりポリADPリボシル化依存的に三者が解離することも明らかとなった。これらの結果は、ポリADPリボシル化による転写因子複合体形成の新しい調節機構を示している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請書に記載した研究計画の通りに研究が遂行している。

今後の研究の推進方策

今後は、PARPによるHSF1やターゲット遺伝子の発現制御について詳細に調べていく。方法としては、HSF1とPARPをノックダウンしたHeLa細胞を用い、両遺伝子で制御されるターゲット遺伝子をDNAマイクロアレイ法によって明らかにする。同様にノックダウンした細胞に熱ショックを加え、同定した新規ターゲット遺伝子の発現変化を定量的RT-PCR法で調べる。同定したターゲット遺伝子のプロモーター領域におけるHSF1やPARPのリクルートをChIP assayで調べる。さらに、その領域でのHSF1-PARP複合体によるクロマチン構造変化の関与についても検討する。
これまでの解析から、熱ストレスによりポリADPリボシル化依存的にHSF1-PARP複合体が解離することを明らかにした。そこで、PARP1によってHSF1が直接ADPリボシル化を受けるかを調べる。HEK293細胞にHSF1-HAを高発現させ、HA抗体でHSF1-HAを免疫沈降し、PAR(Poly(ADP Ribose))抗体を用いてウエスタンブロット法でHSF1のポリADPリボシル化を同定する。検出感度が低い場合は、精製したGST-HSF1、PARP-13-HisあるいはHSF1に結合するPARP-Hisと32P-NAD+を反応させ、SDS-PAGEにより放射ラベルされたHSF1を検出する。この解析から、HSF1の新たな熱ストレス後の修飾を提唱したい。

研究成果

• [雑誌論文] Heat shock factor 1 accelerates hepatocellular carcinoma development by activating nuclear factor κB/mitogen-activated protein kinase (2014)
  • 著者名/発表者名: Makoto Chuma、Naoya Sakamoto, Akira Nakai, Shuhei Hige, Mitsura Nakanishi, Mitsuteru Natsuizaki, Goki Suda, Takuya Sho, Kanako Hatanaka, Yoshihiro Matsuno, Hideki Yokoo, Toshiya Kamiyama, Akinobu Taketomi, Gen Fujii, Kosuke Tashiro, Yoko Hikiba, Mitsuaki Fujimoto, Masahiro Asaka, Shin Maeda.
  • 雑誌名: Carcinogenesis 巻: 35 ページ: 272-281
  • DOI: 10.1093/carcin/bgt343
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chicken IL-6 is a heat-shock gene (2013)
  • 著者名/発表者名: Ramachandran Prakasam, Mitsuaki Fujimoto, Ryosuke Takii, Naoki Hayashida, Eiichi Takaki, Ke Tan, Fangxu Wu, Sachiye Inouye, Akira Nakai.
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 587 ページ: 3541-3547
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.09.012
  • 査読あり
• [学会発表] HSF1-PARP13複合体は非ストレス下で熱ショック誘導に必要なPARP1を留めている (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤本 充章
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド ・ 神戸
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] PARP13はHSF1を介するHSP70誘導に必要である (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤本 充章
  • 学会等名: 日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 ・ 横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
• [備考] 山口大学大学院医学系研究科医化学分野
  • URL: http://ds22.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~seika2/index-3.html