| 研究課題/領域番号 |
25440011
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
釣本 敏樹 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (30163885)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 複製フォーク / DNAポリメラーゼ / in vitro複製 |
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| 研究実績の概要 |
精製されたヒトの複製フォークの主要な構成因子を組み合わせて、機能的な真核生物型複製フォークの構築をすることでヒト複製フォークの反応過程を３種の精製DNAポリメラーゼで再現し、複製フォークの進行が３DNAポリメラーゼで行われることの生化学的検証を目的とする。
これまでにヒトDNAポリメラーゼδ、εを精製した。さらに複製フォークの駆動DNAヘリカーゼであるヒトCMG複合体の構成因子11種類をヒトの293T細胞で共発現させ、CMG複合体を再構築した。さらにこの精製標品を使って高いDNA ヘリカーゼ活性を検出した。これにより精製DNAポリメラーゼとヘリカーゼを組み合わせたDNA合成系の解析が可能となった。
ヒトDNAポリメラーゼδ、εの機能様式が区別されるしくみとして、DNAポリメラーゼεに特異的に結合するPCNAローダーCtf18-RFCに着目した。Ctf18-RFCのPCNA ローディング活性、DNAポリメラーゼεとのプライマー DNA 3’末端での複合体形成を詳細に解析した。その結果、両者が複合体として協調的にプライマー DNA 3’末端に結合し、PCNAのローディングが促進されることが示された。このことから、DNAポリメラーゼε/Ctf18-RFC複合体は、リーディング鎖DNAポリメラーゼの構成要素として機能することが考えられた。したがってリーディング鎖、ラギング鎖の協調的な合成には、リーディング鎖側へのPCNAローディングも重要な機能を持つことが予想できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
再構築した活性型ヒトCMGヘリカーゼ活複合体が精製できた。これと精製DNA ポリメラーゼを組み合わせて、リーディング鎖側のDNA 合成反応の再構築が可能となった。
DNAポリメラーゼεの特性を決めるしくみとして、PCNAローダーCtf18-RFCとの相互作用を詳細に解析できた。これをもとにして、DNAポリメラーゼε/Ctf18-RFC複合体がリーディング鎖合成時に機能しているモデルが提示できた。
出芽酵母でも同様のDNAポリメラーゼε/Ctf18-RFC複合体が機能していることを示した。さらにこの相互作用が、出芽酵母の染色体安定性に重要であることを示した。
出芽酵母の複製因子発現系を作成し、ヒト複製因子で示した特性を出芽酵母の因子で検証することが可能になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
活性型ヒトCMG複合体の精製が可能になったことから、精製を継続し、これと精製DNAポリメラーゼεによるリーディング鎖型DNA合成の再構築を進める。さらにこれにCtf18-RFCによるPCNAローディングを連動させ、実際の機能状態に近い複合体によるDNA合成様式の解析を行う。これとDNAポリメラーゼδ、RFCによるラギング鎖型DNA合成の比較を行う。この上で、２種類のDNA合成を連動させ、両鎖の協調的合成の再構築を行う。
また、出芽酵母由来の同じ複製因子の発現系を構築した。そこで、これらの精製を進め、同様の解析を行う。それぞれの反応系の特性を比較し、真核生物複製フォークの一般的反応機構を提示する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
キャンパスの移転で研究の実施が、実質約５ヶ月中断したため、研究費基金の繰り越しを申請し、当該金額を本研究課題継続分の26年度使用研究費として承認されたことによる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
移転による中断で遅れた研究内容について、当該金額の研究予算内で、所定の成果を上げるのに必要な研究を速やかに実施する。
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