ヒト細胞複製フォーク３DNAポリメラーゼモデルの生化学的検証

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25440011
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 釣本 敏樹 九州大学, 理学研究院, 教授 (30163885)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 複製フォーク / DNAポリメラーゼ / in vitro 複製

研究実績の概要

精製されたヒトの複製フォークの主要な構成因子を組み合わせて、３種の精製DNAポリメラーゼで構成される真核生物型複製フォークの反応過程を再現する。これを使って、機能の異なる３種のDNAポリメラーゼによって真核生物の複製フォークが進行することの生化学的な背景を明らかにすることを目的とする。
ヒトDNAポリメラーゼδ、εを精製した。さらに複製フォークの駆動DNAヘリカーゼであるヒトCMG複合体の構成因子11種類をヒトの293T細胞で共発現させ再構築し、DNA ヘリカーゼ活性を有する高度に精製した標品を調製した。これにより精製DNAポリメラーゼとヘリカーゼを組み合わせたDNA合成系の解析が可能となった。
ヒトDNAポリメラーゼδ、εの機能様式が区別されるしくみとして、DNAポリメラーゼεに特異的に結合するPCNA装着複合体Ctf18-RFCに着目した。Ctf18-RFCのPCNA 装着活性の詳細な解析により、Ctf18-RFCがDNAポリメラーゼεと複合体を形成した時に、両者が協調的にプライマー DNA 3’末端に結合し、高いPCNA装着が発揮されることを示した。このことから、DNAポリメラーゼε/Ctf18-RFC複合体は、リーディング鎖DNAポリメラーゼの構成要素として機能することを提唱した。さらにこの複合体のリーディング鎖側への能動的なPCNA装着活性を考慮すると、リーディング鎖、ラギング鎖の協調的なDNA合成には、両鎖間で協調したPCNA装着が重要であることが考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] The dominant role of proofreading exonuclease activity of replicative polymerase ε in cellular tolerance to cytarabine (Ara-C). (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsuda M, Terada K, Ooka M, Kobayashi K, Sasanuma H, Fujisawa R, Tsurimoto T, Yamamoto J, Iwai S, Kadoda K, Akagawa R, Huang SN, Pommier Y, Sale JE, Takeda S, Hirota K.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.18632/oncotarget.16508.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Human CTF18-RFC clamp-loader complexed with non-synthesising DNA polymerase ε efficiently loads the PCNA sliding clamp. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujisawa R, Ohashi E, Hirota K, Tsurimoto T.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1093/nar/gkx096.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] MutSα maintains the mismatch repair capability by inhibiting PCNA unloading. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawasoe Y, Tsurimoto T, Nakagawa T, Masukata H, Takahashi TS.
  • 雑誌名: Elife. 巻: 5 ページ: e15155
  • DOI: 10.7554/eLife.15155.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Yang CC, Suzuki M, Yamakawa S, Uno S, Ishii A, Yamazaki S, Fukatsu R, Fujisawa R, Sakimura K, Tsurimoto T, Masai H. (2016)
  • 著者名/発表者名: Claspin recruits Cdc7 kinase for initiation of DNA replication in human cells.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 7 ページ: 12135
  • DOI: 10.1038/ncomms12135.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In vivo evidence for translesion synthesis by the replicative DNA polymerase δ. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hirota K, Tsuda M, Mohiuddin, Tsurimoto T, Cohen IS, Livneh Z, Kobayashi K, Narita T, Nishihara K, Murai J, Iwai S, Guilbaud G, Sale JE, Takeda S.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: 44 ページ: 7242-7250
  • DOI: 10.1093/nar/gkw439.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Conserved interaction of Ctf18-RFC with DNA polymerase ε is critical for maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. (2016)
  • 著者名/発表者名: Okimoto H, Tanaka S, Araki H, Ohashi E, Tsurimoto T
  • 雑誌名: Genes Cells. 巻: 21 ページ: 482-491
  • DOI: 10.1111/gtc.12356.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Rapid Purification and Characterization of Mutant Origin Recognition Complexes in Saccharomyces cerevisiae. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawakami H, Ohashi E, Tsurimoto T, Katayama T.
  • 雑誌名: Front Microbiol. 巻: 7 ページ: 521
  • DOI: 10.3389/fmicb.2016.00521.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Rad9 C末端による9-1-1クランプへの蛋白質結合の制御 (2017)
  • 著者名/発表者名: 大橋 英治、岩田 直也、釣本 敏樹
  • 学会等名: 第34回染色体ワークショップ・第15回核ダイナミクス研究会合同
  • 発表場所: 木更津市
  • 年月日: 2017-01-11 – 2017-01-13
• [学会発表] PCNA結合蛋白質のRad9-Hus1-Rad1リングとの結合メカニズム (2016)
  • 著者名/発表者名: 大橋英治、岩田直也、釣本敏樹
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会シンポジウム
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-12-02
  • 招待講演
• [学会発表] Polεを足場にしたCtf18-RFCによる動的PCNAローディング (2016)
  • 著者名/発表者名: 釣本 敏樹 藤澤 遼 大橋英治
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会シンポジウム
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-11-30
  • 招待講演
• [学会発表] Ctf18-RFC bound to Polε loads PCNA efficiently. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujisawa R, Ohashi E, Hirota K, Tsurimoto T
  • 学会等名: The 10th 3R Symposium
  • 発表場所: Matsue, Japan
  • 年月日: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Intramolecular folding of Rad9 C-terminal tail in the Rad9-Hus1-Rad1 checkpoint clamp regulates its interaction with DNA damage response proteins. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohashi E, Iwata N, Tsurimoto T
  • 学会等名: The 10th 3R Symposium
  • 発表場所: Matsue, Japan
  • 年月日: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • 国際学会
• [図書] Functions of multiple clamp and clamp-loader complexes in eukaryotic DNA replication in "DNA Replication: From Old Principles to New Discovery” Advances in Experimental Medicine and Biology, (2017)
  • 著者名/発表者名: Ohashi E, Tsurimoto T
  • 総ページ数: in press
  • 出版者: Springer
• [図書] 分子遺伝学 in 遺伝学（遺伝子から見た生物）鷲谷いずみ、桂勳編 (2017)
  • 著者名/発表者名: 釣本敏樹
  • 総ページ数: 32
  • 出版者: 培風館
• [備考] 染色体機能学研究室複製グループ
  • URL: http://seibutsu.biology.kyushu-u.ac.jp/~chromosome/