| 研究課題/領域番号 |
25440015
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
野口 恵一 東京農工大学, 学術研究支援総合センター, 准教授 (00251588)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ナノ粒子 / ナノ構造体 / 蛋白質シェル構造体 / ウィルス様粒子 / 結晶構造 / Ｘ線回折 / 透過電子顕微鏡 / 認識配列 |
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| 研究概要 |
エンカプスリン は，分子量 30-40 kDa の単一のタンパク質サブユニットが自己集合することにより形成される直径 20-55 nm の中空の球状ナノ構造体である．特定の酵素を内包することにより，効率的な反応場や細胞にとって毒性のある基質や生産物を隔離する場を提供する細胞内微小区画であると考えられており，構造体のサイズ，安定性，内包する酵素を制御することが可能となれば，マイクロリアクターやドラッグデリバリーキャリアーとしての活用が期待される．本研究では，エンカプスリンへの変異導入による構造体の形状，安定性，及び内包酵素の選択性などに与える影響について検討を行い，構造形成や酵素取込機構を明らかにすることを目的として研究を進めている．
当初，Rhodococcus. erythropolis N771由来エンカプスリンサブユニットをC末端にHisタグ配列を付加した組換え体として発現させ，アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行っていた．しかし，再構成したエンカプスリンの分子量測定の結果，主要成分である分子量1.8MDaの構造体に加え，存在比は少ないがその２倍程度の分子量を持つ構造体の形成を示唆する結果が得られた．そこで，結晶化にあたり単一のシェル構造体のみを得るために，タグを付加しない組換え体の発現系を作製し，精製方法を確立した．透過電子顕微鏡観察，分子量測定によりナノ構造体の形成を確認後，精製したエンカプスリンを用いて結晶化実験を開始し，複数の結晶化条件を得ることに成功した．次に，結晶化条件の最適化を行うため，異なる条件で得た単結晶について放射光での回折実験を行った．その結果，分解能 4 - 8 Åの回折像を収集し，予備的な単位格子を得ることに成功した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
結晶化条件探索の初期段階で得た結晶の回折データの分解能は10Å程度であったが，条件検討を進めることにより，現在，分解能は4Å程度まで向上している．現状の回折データの分解能はＸ線結晶構造解析に十分なものではないが，これまでに得た複数の結晶化条件とデータ収集条件（結晶の凍結条件など）の最適化を進めていくことで分解能の更なる向上が期待できる．当初より，平成25年度に予備的な回折測定を開始し，本格的なデータ収集は平成26年度以降となると見込んでいたので，Ｘ線回折実験はほぼ予定通りに進行している考えられる．
また，エンカプスリンに内包されるタンパク質の取り込み機構を明らかにするために，平成25年度は内包タンパクに付加される認識配列の探索を行った．Rhodococcus. erythropolis N771由来エンカプスリンの遺伝子の上流にコードされているペルオキシダーゼのC末端部に認識配列と推定できる配列の存在が確認できため，この配列を付加した緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼの発現系を構築し，エンカプスリンとの共発現，精製を行い，エンカプスリンへの内包の可否について検討を進めている．エンカプスリンに付加したHisタグを用いたアフィニティー精製により，エンカプスリンと緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼが同一フラクション内に存在することが確認できたことから，内包される可能性が示唆された．したがって，内包タンパク取り込み機構解析に関しても研究は順調に進んでいると考えられる．
以上より，研究全体として，おおむね計画通りに進展していると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
結晶解析については，引き続き高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーにて回折実験を継続する．平成25年度の実験結果より，ビームサイズの細いマイクロビームラインでの測定時間が多く必要になると判断できたことから，ビームタイム確保のため新たな実験課題の申請を行う予定である．結晶化条件の最適化が順調に進めば，構造解析用のデータ収集は平成26年度後半となる見込みである．ほぼ同じ大きさのシェル構造体の形成が確認されていることから，構造解析は，Thermotoga maritima由来エンカプスリンの構造を基に分子置換法で行う予定である．
認識配列の付加によるエンカプスリンへの緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼの内包の可否についてさらに検討する．具体的には，エンカプスリンと緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼを共発現し，エンカプスリンに付加したHisタグを用いたアフィニティー精製物に対してタンパク質消化酵素処理を行い，緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼの分解が抑制されるか否かについて検討することにより，内包の可能性をより明確にする．また，精製物の蛍光強度の定量的な評価を行い，エンカプスリン中に含まれる緑色蛍光タンパク質の量を推定する．
エンカプスリンをマイクロリアクターやドラッグデリバリーキャリアーとしての活用するためには，ナノ粒子としての安定性が重要となる．そこで、温度変化，pH 変化に対する粒子の安定性を動的光散乱測定や透過電子顕微鏡観察により検討する．
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