| 研究課題/領域番号 |
25440017
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北陸先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
大木 進野 北陸先端科学技術大学院大学, ナノマテリアルテクノロジーセンター, 教授 (70250420)
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| 研究分担者 |
森 正之 石川県立大学, 生物資源工学研究所, 准教授 (00320911)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 植物 / 膜タンパク質 / NMR |
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| 研究概要 |
平成25年度は、発現系の確立と精製方法の確立を目指した。発現系には一般的な大腸菌の系のほか独自技術である植物培養細胞の系の両方を用いた。アミノ酸配列から予測されたTMMのドメイン構造をもとにして、N末端ドメイン、LRR（ロイシン・リッチ・リピート）ドメイン、膜貫通ドメインの3種類について両方の系で発現系を構築した。精製を簡単にするためにHis x 6タグとGSTタグを利用した。それぞれの発現系について最適な培養条件、誘導をかけるタイミング、誘導後の培養時間などを最適化した。この結果、いくつかの系においては非常に高い効率での試料発現が可能であることがSDS-PAGEによって確認できた。この系においては、発現した試料タンパク質が可溶性分画と沈殿分画にほぼ同程度存在していた。
次に、この発現系で生産した融合タンパク質を精製する方法の確立を試みた。始めに可溶性分画からの精製を試みた。NiアフィニティーカラムもしくはGSTレジンで粗精製した試料を質量分析したところ、試料の分子量が不均一であることが確認された。このことは、発現された試料タンパク質が分解している可能性を示唆しており、均一な試料が必要なNMRやX線結晶構造解析などの分析には不向きな試料であると考えられた。現在は、沈殿分画にある融合タンパク質を変性剤で可溶化することで回収し、ここからの精製を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に各種のドメインを含むフラグメント化した試料の発現を試した。この結果、良好な試料発現の系を構築することができた。また、それについて、現在、調製の方法を確立中であり、試料を調製する見通しがつきつつある段階である。このまま研究が遂行すれば、2年目に純度の高い試料を調製することができると予想される。その試料を用いてCDやNMRなどの物理化学的分析手法で、構造と物性に関しての各種データを計測できる可能性が高まった。従って、これまでの研究はおおむね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
試料調製方法を確立する。また、ドメインをタンデムに連結した比較的分子量の大きい試料や両端にunstructuredと予測される領域を付加したドメインについても2種類の試料調製系で発現を試みたい。
精製した試料を用いてCDやNMRの実験を行い、立体構造情報を得る。また、タンパク質の一部もしくは全体を安定同位体標識した試料を調製し、解析可能なNMRデータを得る。
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