| 研究課題/領域番号 |
25440022
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
松村 浩由 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324809)
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| 研究分担者 |
向 由起夫 長浜バイオ大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (60252615)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Tup1-Cyc8複合体 / コリプレッサー / 構造機能相関 |
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| 研究概要 |
「Tup1-Cyc8コリプレッサー複合体がどのような複合体を形成し転写抑制機能を発揮しているのか」を構造学的視点から調べるために、Tup1N-Cyc8複合体の結晶化を行った。その結果、0.6 M Magnesium sulfate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 4% v/v 2-Methyl-2,4-pentanediolの条件において最も分解能が高く、回折点に伸びがない回折データが得られた。しかし、現状での分解能は6Åと構造解析には困難であった。分解能の向上を目指した結晶化条件の最適化を行い、さらにその蛋白質の分散度が評価できるＸ線溶液散乱法を用いて単分散性を評価し、その情報をもとに混合の割合等を変化させたが、構造解析に適した結晶は得られていない。また、機能解析については、Tup1のアミノ酸72-93の領域が重要であることが示唆され、さらにアミノ酸74-76をアラニンに置換した変異体の転写抑制能を解析したところ、その機能の喪失が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
構造研究に関してはTup1N-Cyc8複合体の結晶は得られたものの、結晶の改良に時間を要している。一方で、機能解析については、Tup1のアミノ酸72-93の領域が重要であることが示唆され、さらにアミノ酸74-76をアラニンに置換した変異体の転写抑制能を解析したところ、その機能の喪失が見られた。また、S. cerevisiae Tup1の中央領域（93-281アミノ酸位）をGST融合タンパク質として大腸菌で発現・可溶化することに成功した。同様にC. albicans Tup1で相当する中央領域（94-139アミノ酸位）の発現にも成功した。大腸菌のレアコドンが原因で発現が困難であった酵母ヒストンH3およびH4タンパク質を大腸菌Rosetta細胞を用いて発現させることができた。Tup1Nに含まれる74-76アミノ酸位の3連続グルタミン酸（EEE）に注目し、部位特異的アラニン置換により、これらの単独（AEE、EAE、EEA）、二重（AAE、AEA、EAA）、三重（AAA）変異株を構築した。三重変異株においてTup1による転写抑制能が失われた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Tup1N-Cyc8複合体の結晶の改良を試みたが困難であったため、Ｘ線溶液散乱法によるTup1N-Cyc8の構造解析を行う。この構造解析の第一の目的は、立体構造から機能未知であるCyc8の機能を解明することであるが、加えて、Cyc8がTup1に結合したことによるTup1の構造変化が、自己会合やヒストン結合能へ与える影響についても考察し、Tup1-Cyc8の分子機構を重層的に理解するために行う。また、機能解析については、上述の結果をうけて、変異体の構造機能解析を行う。その変異タンパク質を大腸菌で発現・精製し、タンパク質相互作用をプルダウン法により解析し、in vitroでの結合活性も確認する。また、ヒストンのポジショニングに対する影響を調べることにより構造機能相関を得る。S. cerevisiae Tup1のN末端（1-92アミノ酸）領域および中央（93-281アミノ酸）領域ついてヒストンH3およびH4との結合をFar-Western法により解析する。それぞれの領域において転写抑制能を失ったTup1変異タンパク質についてヒストンとの相互作用を解析する。
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