| 研究課題/領域番号 |
25440030
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
丹羽 一 九州大学, カーボンニュートラル・エネルギー国際研究所, 特任助教 (30610266)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 蛋白質複合体 / 蛋白質相互作用 / ペルオキシソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細胞質で合成されるペルオキシソーム膜蛋白質（Peroxisomal Membrane Protein; PMP）の正しい折りたたみと可溶化を助け、ペルオキシソームへ移送するシャペロン蛋白質Pex19pの結晶構造解析を中心とした構造生物学的アプローチで、PMPのペルオキシソーム特異的移送メカニズムの解明を目指している。Pex19pのN末領域はプロテアーゼ感受性で、一次配列からも、単独では決まった構造を取らない天然変性蛋白質の一種ではないかと推測しているが、この領域を固定化するためにMBPといった大きな蛋白質タグをN末に配し、MBPの最後のヘリックスをPex19pのN末端ヘリックス（15-40aaがPex3pとの共結晶構造からヘリックスであることがわかっている）と繋げることで、構造的に強固なもとし、Pex19p全長の結晶化を行っている。またこのフレキシブルなN末領域は、ペルオキシソーム膜蛋白質輸送に必須のPex3pだけでなく、マトリックス蛋白質輸送に必須のPex14pとも相互作用することがわかっており、Pex19p/Pex14p安定複合体の結晶化も進めている。これまで結晶構造が報告されているPex19p（66-77aa）ペプチドとPex14p（25-70aa）の双方を延長する形で、Pex19p-N末領域とPex14pの細胞質領域との安定な複合体の結晶化も行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Pex14pの膜貫通領域（Trans-Membrane region; TM）にPex19p結合保存配列があるが、このTMを削った変異Pex14pDTMもPex19pと安定な複合体を形成することが複合体形成実験からわかった。一方、共結晶で見られた相互作用に重要な残基をアラニンに置換したPex14pF35Aは、野生型Pex19pと相互作用しなくなったことから、Pex14pはF35を主とする相互作用だけでPex19pと結合していると考えられる。逆に、Pex19pの66-77aaペプチドは、結晶中で見られる相互作用に重要な残基F70、F71、F75（human Pex19p）を全てアラニンに置換してもなお野生型Pex14pと複合体を形成した。つまりPex19pでは66-77aaだけでPex14pと相互作用しているわけではない。このことはin vivoでの変異細胞相補能でも同じ結果が確認されている。ただPex19pのC末ドメインはPex14pとは結合せず、フレキシブルなN末領域がPex14pの結合に重要であることが実験的に示されていることから、このPex19pのフレキシブルなN末領域が、その構造的な特徴を利用して、複数箇所で、柔軟にPex14pと多様な相互作用をしていると結論した。
こうした、単独では構造を持たないPex19pの性質が、本質的にその機能に重要であり、それゆえに非常に構造生物学的アプローチを難しくしていることが、研究の進捗状況に影響を与えていると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの実験結果から、Pex19p/Pex14p複合体が複数の複合体状態の混在である可能性が強く示唆された。そしてPex19p/Pex14p安定複合体の結晶化に際し、単一の複合体状態を作り出すことが重要であると結論できた。そこでPex19pのこれまで知られていないPex14p相互作用部位を特定することが必須となってくる。このために、Pex19pまたはpex14pの様々な変異体を作成し、複合体形成実験を行う。Pex19pとPex14pの相互作用部位が全て特定できれば、単一の結合状態からなる複合体となる変異体複合体を精製し、結晶化を行うことが可能となる。こうしたPex19pの、単独では構造を持たないという構造上の特徴が、本質的にその機能に重要であり、それゆえに非常に構造生物学的アプローチを難しくしているが、逆にその困難を克服し構造解析に成功すれば、その構造情報から、Pex19pのシャペロンとしての働き、PMPの認識様式、さらには既知のPex3p構造とのモデリングから、PMPの膜挿入メカニズムにも迫る知見が得られると期待できる。
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