| 研究課題/領域番号 |
25440036
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
生城 浩子 大阪医科大学, 医学部, 講師 (10280702)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | スフィンゴ脂質 / 酵素 / フモニシン / セリンパルミトイル転移酵素 |
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| 研究実績の概要 |
①フモニシン合成系のkey enzymeであるFum8pの大量発現：Fum8pの疎水性領域を欠失させた変異型タンパク質の大腸菌内発現系を作製し、酵素精製を試みたが，未だ活性な酵素タンパク質を得るに至っていない。
②フモニシン合成系のもう一つのkey enzymeであるFum13pの大量発現：Fum13pの大腸菌内大量発現系の改良を加え，組換えタンパク質の精製を行ない，酵素活性を確認した。
③セリンパルミトイル転移酵素SPTについて：細菌SPTについて高分解能のX線構造解析が可能な結晶調製に成功したが，リガンドとの複合体結晶の立体構造解析には結晶の性質が適さないことが判明した。新しい結晶化条件の検索を行ない，いくつかの結晶が得られ，構造解析を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
Fum8pの組換えタンパク質の発現系構築が計画通りに進行しないために，研究計画全般に遅れを来している。Fum13pに関してはおおむね計画通りに進行できているが，本研究で第一の実験対象と位置づけているFum8pの進捗の遅れが影響を及ぼしている。ヒトSPTについても組換えタンパク質の発現系構築の達成が不十分なために，研究計画全般に遅れを来している。細菌SPTで高分解能の結晶が得られ始めたので，実験の力点が細菌の酵素にやや偏ってしまったことも影響した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Fum8pとヒトSPTについては昆虫細胞を用いた発現系を試みる予定である。
また、大腸菌内発現系について、膜タンパク質の可溶性を向上させるよう設計された変異を導入する試みを勧めている。
順調に実験計画が遂行できているFum13pの構造解析と、酵素学的性状解析をより一層推進させる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
組換えタンパク質の発現系の構築の難行が解決できていないために，精製組み換え酵素を用いて行なう活性測定や結晶構造解析に十分に取りかかることができず，また，計画に沿って進行できた研究成果の論文作成が遅れており，基質やキットの購入費に計上していた試薬代や論文投稿費、実験目的での学外研究施設への交通費，学会発表のための費用が次年度使用額として繰り越す結果となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
大腸菌内組み換え酵素発現系改良のための遺伝子操作実験に伴う人工遺伝子合成代金，発現条件を最適化するための特殊な組成の培地，昆虫細胞を用いたタンパク質発現実験に伴う試薬購入，学外研究機関への実験のための往復交通費や機器使用量，論文投稿，学会発表のための費用に活用する予定である。
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