| 研究課題/領域番号 |
25440055
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 神奈川工科大学 |
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研究代表者 |
小池 あゆみ 神奈川工科大学, 応用バイオ科学部, 教授 (20454176)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | シャペロニン / タンパク質 / フォールディング / GroEL |
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| 研究概要 |
我々は、シャペロニンGroELの２つのリングが同時に活性状態にあるフットボール型反応中間体を経由するダブルストローク反応モデルを提案している。in vitro の実験系で検証されたこのモデルが、細胞内におけるGroEL の作用機構にもあてはまるか確認するため、細胞内光クロスリンク技術により細胞内で形成されたフットボール型複合体の検出を行った。光反応性のアミノ酸アナログであるパラベンゾイルフェニルアラニン(pBpa)をGroESのGroEL結合部位に取り込ませ、pBPA とGroELとの間に紫外線照射によって架橋を形成させて細胞内で形成したGroEL複合体を分析した。Native PAGE、ウェスタンブロッティングで解析したところ、細胞内において、１分子のGroELに１分子のGroESが結合した弾丸型GroES-GroEL複合体に加え、１分子のGroELに２分子のGroESが結合したフットボール型GroES-GroEL-GroES複合体が形成していた。さらに、温度ストレスにより変性タンパク質が増加した環境下の大腸菌細胞内においては、光クロスリンクしたGroEL/GroES 複合体が増加している可能性が示唆された。フットボール型複合体は、７量体リング２つに分かれてシングルリングを形成しやすく、シングルリングになるとATP 加水分解終了後もポリペプチドは放出されないことから、変性タンパク質の長時間保護が可能と予想される。Thermus thermophilus GroEL/GroES複合体において、過去にシングルリング形成の報告があるが、フットボール型複合体との関連性が不明なため、現在Thermus thermophilusでのフットボール型複合体形成の検証をしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
大腸菌細胞内でフットボール型複合体が形成されること、熱ストレス条件下でクロスリンク産物が増加する可能性があることを、細胞内光クロスリンク技術で検出することができた。ストレス条件の有無で各複合体の生成比を定量することができれば、フットボール型中間体の意義について考察できると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、細胞内に存在する、弾丸型、フットボール型、シングルリング複合体のそれぞれの生成比と、培養条件による変化を細胞内光クロスリンク技術で定量する。また、FCCS技術で生細胞内の各複合体存在比も検証し、細胞内GroEL/GroESの反応機構の解明につなげたい。
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