| 研究課題/領域番号 |
25440059
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小野 弥子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主席研究員 (20392376)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | カルパイン / ノックアウトマウス / プロテアーゼ / タンパク質代謝 |
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| 研究実績の概要 |
1)昨年度に行った培養細胞でのプロテオーム解析の条件を利用して、野生型とCAPN7ノックアウトマウス組織の比較プロテオーム解析を行った。ノックアウトマウスでは新生仔致死となるため、出生直後のマウスから採取した複数の臓器を解析対象とし、野生型とノックアウトマウスとで顕著に発現量が異なるタンパク質を同定することができた。いくつかのタンパク質については、各臓器の組織染色像との関係および文献情報をもとに、機能異常を示唆するものと判断している。しかし、CAPN7の欠損が直接の原因かという点については、検討が必要である。
2)上記解析を相補する目的で、CAPN7が組織普遍的に発現することを利用し、選択した組織（骨格筋や心筋など）におけるCAPN7の動態についての解析を開始した。内在性のCAPN7を検出することが困難であったため、恒常的かつ全身性にカルパイン7（野生型およびプロテアーゼ活性失活変異体）を発現するトランスジェニックマウスの組織をもちいて、局在を検討している。また、酵母と培養細胞を用いて、相互作用タンパク質の検索を行ったが、これまでのところ、既存の実験結果の解釈を著しく発展させるような候補分子は得られておらず、条件の再検討が必要である。
3)CAPN7のノックアウトマウスの中で、野生型CAPN7のトランスジェニックによって致死性を回避できたもの、を重点的に解析するため、飼育スケールを拡大した。12ヶ月以上の飼育を予定して、成長具合を観察中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新生仔の臓器を用いたプロテオーム解析の結果は、興味深いものであったものの、観察対象が発散してしまった。そのため、根本的な異常の特定に至るために、組織毎に補完的な解析手段を検討することが必要と判断し、その分時間がかかることになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、プロテオーム解析の結果を精査し、解析対象とする分子数を減らした上で、優先順位をはっきりさせる。相互作用タンパク質の検索については、協力関係にある研究者からの助言をもとに、質量分析を活用した新しい手法を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
データ解析に時間がかかったため、その次の段階で必要な試薬（抗体や合成オリゴなど）の購入が遅れてしまった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
年度後半より、解析するマウスの種類は減らしてN数を増やすべく方針を修正したので、それにかかる費用は次年度に必要額が多くなると想定している。
また、新たに、細胞培養を用いたタンパク質スクリーニングを始めるための試薬やキットの購入に使用する。
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