| 研究課題/領域番号 |
25440059
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小野 弥子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主席研究員 (20392376)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | カルパイン / プロテアーゼ / 細胞内局在 / 進化的保存性 |
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| 研究実績の概要 |
1) 昨年度より、CAPN7-Tgマウス（野生型・不活性変異型CAPN7発現）の飼育数をそろえて成長具合について長期比較した。野生型Tgについては、KOマウスの致死性を回避できた後、体格が矮小になる傾向にあると感じられたが、得られた産仔数においては統計的に有意な差を示すことはなかった。採取した、各種臓器については、順にプロテオーム解析の準備を行った。転写産物の比較も行うこと、組織からのプルダウン実験を、遺伝子型ごとに比較するため、サンプルをそろえているところである。
2) 大腸菌由来のビオチン化酵素変異体との融合タンパク質として、培養細胞にCAPN7を発現させた後、近隣に存在した可能性があるタンパク質を網羅的に質量分析器で同定した。その中に、すでに、別の系で相互作用が報告されているタンパク質が含まれていたので、関連分子の見当をつけるという目的に合っていると判断した。
その後、複数回の条件検討と、得られたデータの精査方法の工夫を行った。次回以降は、細胞に増殖因子などの刺激を与えた時の近隣局在タンパク質を同定する。
3) 既報のCAPN7相互作用タンパク質についての報告を比較検討し、ストレスに応答して活性変動が見られるタンパク質に着目した。そのタンパク質について、CAPN7遺伝子改変マウス、Tgマウスにおける挙動を検討するために、実験法・物品の準備を行った。また、相互作用に必要な領域を絞り込むため、欠失変異体の比較検討を始めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新しくビオチン化酵素を利用したアッセイ系は、CAPN7の近傍に位置するタンパク質を網羅する目的には即しているようだが、得られるデータ量を精査するための思考実験に時間がかかってしまった。
別途、検討をつけて相互作用を解析しているタンパク質グループについて、コンストラクトのデザイン・作製など、技術的な部分で要領よくこなすことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
新規に取り入れた相互作用アッセイ系に加えて、CAPN7の発現を培養細胞以外の系（in vitro 翻訳系など）で行い、活性発現の条件を確定する。CAPN7のプロテアーゼ活性について、構造機能相関の部分では情報があまりないので、その部分を補完するデータを得ることを目的とする。また、マウス組織のプロテオーム解析の結果から同定した、CAPN7と関係ありそうなタンパク質について、検出のための試薬がそろっているメジャーなタンパク質について、特に出生前後における挙動を調べたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1) 新規に行った質量分析装置による解析において、必要なサンプル量が実際には微量で済んだため、細胞培養などの規模を縮小・培地その他の消耗品の使用量が減った。
2) マウスの観察が長期に渡ったため、新規購入などの費用が予定ほど必要ではなくなった。
3) 購入したい抗体や試薬について、良いものがなかなか見つからなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
1) 新しい抗体の購入、発現用コンストラクトの作製費用が、昨年度よりは必要となる。
2) マウスから採取したサンプルについて、転写産物の解析を依頼するようになるので、その分の消耗品・技術量として使用したい。
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