シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質の小胞体における品質管理

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25440060
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 独立行政法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 小亀 浩市 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40270730)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: タンパク質品質管理 / 小胞体 / プロリン異性化酵素 / ADAMTS13

研究概要

タンパク質を構成するプロリン残基のシス-トランス異性化は、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase（PPIase）という一群の酵素によって触媒される反応であり、タンパク質の立体構造形成（フォールディング）と機能発現にとって重要である。本研究では特に分泌タンパク質の品質管理におけるPPIaseの役割に着目し、シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質のフォールディング過程と、遺伝子変異等で生じる構造異常タンパク質の分解処理過程に関する解析を行っている。我々は最近、血中メタロプロテアーゼADAMTS13の基質認識を担うDTCSドメインの結晶構造を決定し、４個のシス型プロリン残基を同定した。そこで本年度は、シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質のモデルとして組換えADAMTS13-MDTCSドメイン（MDTCS）を利用し、そのフォールディングに対するPPIaseの関与を調べた。正常にフォールディングしたMDTCSの量は、細胞外に分泌されたMDTCS量の測定で見積もることができる。MDTCSを恒常的に発現するCHO細胞を、cyclophilin阻害剤であるシクロスポリンA存在下で培養し、培地に蓄積するMDTCS量を抗体およびADAMTS13特異的合成基質で定量した結果、シクロスポリンA用量依存的にMDTCSの分泌量が減少することが明らかになった。一方、FKBP（cyclophilin群と異なるPPIase群）阻害剤であるFK506の効果は弱かったため、MDTCSの分泌はPPIase群の中でもcyclophilin群に特異的であると考えられた。次に、小胞体PPIase B（cyclophilin B; CypB）の発現を抑制するsiRNAで同細胞を処理した結果、CypBの細胞内発現量の減少とともに、MDTCSの分泌量も減少した。一方、細胞質の代表的PPIaseであるCypAに対するsiRNA処理では、CypAの発現量は減少したものの、MDTCSの分泌量はほとんど影響を受けなかった。したがって、MDTCSの正常な分泌にはプロリン残基のシス化が必要であり、その反応は主にCypBが担うことが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、分泌タンパク質であるADAMTS13の小胞体における正常なフォールディングにプロリン残基のシス-トランス異性化が重要であることを証明し、その異性化に関与する酵素を特定することを主な目的としていた。そのためにADAMTS13-MDTCSを発現する細胞を利用し、シクロスポリンやFK506等のPPIase選択的阻害剤、CypB発現を抑制するsiRNA等の効果を調べ、ADAMTS13の分泌にはプロリン残基のシス化が重要であることと、そのシス化反応にCypBが強く関与することを明らかにした。したがって、研究実施計画の立案時に想定していた最も重要なデータを得ることができたと言える。一方、CypBおよび不活性型CypB（R95A変異体）を過剰発現させる培養細胞実験系や、ADAMTS13変異体に対するCypBの関与を調べる実験については、さらなる追加解析が必要で、次年度以降にも継続する。また、CypBが小胞体関連分解（ERAD）で機能することを示す実験にも注力する必要がある。

今後の研究の推進方策

本研究の計画立案当初は、初年度の研究実績をベースに論文を作成する予定であった。しかし、着想の相違はあったものの、米国の研究グループからきわめて類似した内容の論文[Hershko et al, JBC 287, 44361-44371 (2012)]が発表されたため、平成26年度以降のデータも含めた形での論文化を想定している。平成26年度にはマウス個体を用いた実験を開始する。まず、野生型マウスにシクロスポリンAを投与した後、あるいはCypBのsiRNAや発現ベクターを導入した後、血中ADAMTS13活性を測定し、CypB機能異常の影響を調べる。siRNAやDNAの導入には、すでに我々が成功実績をもつin vivoハイドロダイナミクス法を使用する。また、ADAMTS13変異体のERADによる分解を解析することで、個体レベルでCypBのERADに対する寄与を観察する。これにもハイドロダイナミクス法を使用する予定である。ADAMTS13以外の分泌タンパク質として、主に血液凝固関連タンパク質も分析対象としたい。平成27年度には、小胞体PPIaseの研究に適したモデル基質の開発を試みる。ADAMTS13およびその変異体を用いた研究成果と、これまでに報告されたフォールディングモデル基質およびERADモデル基質の知見をもとに、小胞体PPIase（主にCypB）の研究に適したモデル基質を考案したい。これを培養細胞あるいはマウスに発現させ、シクロスポリンやsiRNA、発現ベクター等の効果を観察することで、CypB等が働く分子機構を詳細に解析する。また、ADAMTS13-P618A多型（Pro-618はシス型）の謎の解明にも挑みたい。P618A多型保有者の血漿ADAMTS13活性は正常であるが、培養細胞でP618A変異体を発現させると分泌量が約20％に低下するという、矛盾する特徴がある。この原因を明らかにすることで、シス型プロリン残基に関する新たな知見が得られると考えている。

次年度の研究費の使用計画

本年度の研究実施計画は概ね予定通りに遂行できたが、物品購入による支出を予想以上に低く抑えることができた。それは、費用面での効率を積極的に考慮し、計画立案当初に予定していた試薬類やキット類、プラスチック製品類などといった消耗品の使用量を可能な限り減らして実験を行うことができたためである。次年度以降の実施計画に予定以上の費用がかかる可能性を考慮したことも一因である。一方、物品費以外の支出は予定額を大きく越えることはなかったため、本年度全体としての所要額は計画当初の予定額を下回り、その差額を次年度に使用することとした。
次年度の研究計画にはマウス個体を使用する実験が多く含まれており、その購入や飼育にかかる費用だけでなく、使用する薬剤等についても本年度以上の出費が予想される。したがって、今回生じた次年度使用額の多くは、実験に要する物品の購入に充当することを予定している。

研究成果

• [雑誌論文] Case of maternal and fetal deaths due to severe congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) during pregnancy (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirokazu Tanaka, Chiaki Tenkumo, Nobuhiro Mori, Koichi Kokame, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Hata
  • 雑誌名: J. Obstet. Gynaecol. Res. 巻: 40 ページ: 247-249
  • DOI: 10.1111/jog.12125
  • 査読あり
• [雑誌論文] A first bout of thrombotic thrombocytopenic purpura triggered by herpes simplex infection in a 45-year-old nulliparous female with Upshaw-Schulman syndrome (2014)
  • 著者名/発表者名: Masanobu Morioka, Masanori Matsumoto, Makoto Saito, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, and Yoshihiro Fujimura
  • 雑誌名: Blood Transfus. 巻: 12 ページ: s153-s155
  • DOI: 10.2450/2013.0307-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] NDRG1 deficiency attenuates fetal growth and the intrauterine response to hypoxic injury (2014)
  • 著者名/発表者名: Jacob Larkin, Baosheng Chen, Xiao-Hua Shi, Takuya Mishima, Koichi Kokame, Yaacov Barak, and Yoel Sadovsky
  • 雑誌名: Endocrinology 巻: 155 ページ: 1099-1106
  • DOI: 10.1210/en.2013-1425
  • 査読あり
• [雑誌論文] Candidate gene analysis using genomic quantitative PCR: Identification of ADAMTS13 large deletions in two patients with Upshaw-Schulman syndrome (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuka Eura, Koichi Kokame, Toshiro Takafuta, Ryojiro Tanaka, Hikaru Kobayashi, Fumihiro Ishida, Shuichi Hisanaga, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata
  • 雑誌名: Mol. Genet. Genomic Med. 巻: 2 ページ: 240-244
  • DOI: 10.1002/mgg3.64
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nonsynonymous mutations in three anticoagulant genes in Japanese patients with adverse pregnancy outcomes (2014)
  • 著者名/発表者名: Reiko Neki, Toshiyuki Miyata, Tomio Fujita, Koichi Kokame, Daisuke Fujita, Shigeyuki Isaka, Tomoaki Ikeda, and Jun Yoshimatsu
  • 雑誌名: Thromb. Res. 巻: 133 ページ: 914-918
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2014.02.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] 血栓性血小板減少性紫斑病 (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博，松本雅則，石西綾美，八木秀男，小亀浩市，宮田敏行
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 55 ページ: 93-104
• [雑誌論文] Upshaw-Schulman症候群のADAMTS13遺伝子解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小亀浩市，樋口（江浦）由佳
  • 雑誌名: 細胞 巻: 46 ページ: 61-63
• [雑誌論文] Crystal structure and enzymatic activity of an ADAMTS13 mutant with the East Asian-specific P475S polymorphism (2013)
  • 著者名/発表者名: Masashi Akiyama, Daisuke Nakayama, Soichi Takeda, Koichi Kokame, Junichi Takagi, and Toshiyuki Miyata
  • 雑誌名: J. Thromb. Haemost. 巻: 11 ページ: 1399-1406
  • DOI: 10.1111/jth.12279
  • 査読あり
• [雑誌論文] Up-regulation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), silent mating type information regulation 2 homologue 1 (SIRT1) and autophagy-related genes by repeated treatments with resveratrol in human umbilical vein endothelial cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshie Takizawa, Yukiko Kosuge, Hiroyo Awaji, Emi Tamura, Ayako Takai, Takaaki Yanai, Reiko Yamamoto, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Rieko Nakata, and Hiroyasu Inoue
  • 雑誌名: Brit. J. Nutr. 巻: 110 ページ: 2150-2155
  • DOI: 10.1017/S0007114513001670
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Satb1 protein directs hematopoietic stem cell differentiation toward lymphoid lineages (2013)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Satoh, Takafumi Yokota, Takao Sudo, Motonari Kondo, Anne Lai, Paul W. Kincade, Taku Kouro, Ryuji Iida, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Yoko Habuchi, Keiko Matsui, Hirokazu Tanaka, Itaru Matsumura, Kenji Oritani, Terumi Kohwi-Shigematsu, and Yuzuru Kanakura
  • 雑誌名: Immunity 巻: 38 ページ: 1105-1115
  • DOI: 10.1016/j.immuni.2013.05.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long term follow up of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) on hemodialysis for 19 years: a case report (2013)
  • 著者名/発表者名: Koki Mise, Yoshifumi Ubara, Masanori Matsumoto, Keiichi Sumida, Rikako Hiramatsu, Eiko Hasegawa, Masayuki Yamanouchi, Noriko Hayami, Tatsuya Suwabe, Junichi Hoshino, Naoki Sawa, Kenichi Ohashi, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Yoshihiro Fujimura, and Kenmei Takaichi
  • 雑誌名: BMC Nephrol. 巻: 14 ページ: 156
  • DOI: 10.1186/1471-2369-14-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] A deficiency of Herp, an endoplasmic reticulum stress protein, suppresses atherosclerosis in apoE knockout mice by attenuating inflammatory responses (2013)
  • 著者名/発表者名: Shohei Shinozaki, Tsuyoshi Chiba, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Eiji Kaneko, and Kentaro Shimokado
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e75249
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0075249
  • 査読あり
• [雑誌論文] Auto-adaptive ER-associated degradation defines a pre-emptive unfolded protein response pathway (2013)
  • 著者名/発表者名: Riccardo Bernasconi, Carmela Galli, Koichi Kokame, and Maurizio Molinari
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 52 ページ: 783-793
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2013.10.016
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAMTS13 activity and genetic mutations in Japanese subjects (2013)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Miyata, Koichi Kokame, Masanori Matsumoto, and Yoshihiro Fujimura
  • 雑誌名: Haemostaselolgie 巻: 33 ページ: 131-137
  • DOI: 10.5482/HAMO-12-11-0017
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAMTS13と血栓性血小板減少性紫斑病 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小亀浩市
  • 雑誌名: 循環器病研究の進歩 巻: 34 ページ: 69-75
• [学会発表] A long-term phenotype analysis of 51 patients with Upshaw–Schulman syndrome in Japan, with special references to pregnancy and renal failure that requires hemodialysis (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Fujimura, Yumi Yoshii, Masanori Matsumoto, Ayami Isonishi, Masaki Hayakawa, Yoko Yoshida, Hideo Yagi, Koichi Kokame, and Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: The 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] 日本における先天性ADAMTS13欠損症の遺伝子解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 樋口（江浦）由佳，小亀浩市，松本雅則，藤村吉博，宮田敏行
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] 血栓性血小板減少性紫斑病患者のADAMTS13遺伝子に伏在していた変異の発見：ゲノムDNAを用いた定量PCR法の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 樋口（江浦）由佳，小亀浩市，松本雅則，藤村吉博，宮田敏行
  • 学会等名: 第18回日本病態プロテアーゼ学会学術集会
  • 発表場所: 豊中
  • 年月日: 20130816-20130817
• [学会発表] Quantitative PCR assay demonstrated exon deletions of ADAMTS13 in two unrelated patients with Upshaw-Schulman syndrome (2013)
  • 著者名/発表者名: Yuka Eura, Koichi Kokame, Toshiro Takafuta, Ryojiro Tanaka, Hikaru Kobayashi, Fumihiro Ishida, Shuichi Hisanaga, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Amsterdam, The Netherlands
  • 年月日: 20130629-20130704
• [学会発表] Exacerbated venous thromboembolism in mice with the protein S Tokushima mutation (2013)
  • 著者名/発表者名: Fumiaki Banno, Toshiyuki Kita, Hiroji Yanamoto, Yuko Tashima, Koichi Kokame, and Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Amsterdam, The Netherlands
  • 年月日: 20130629-20130704
• [学会発表] Quantitative PCR-based analysis of ADAMTS13 genetic defects (2013)
  • 著者名/発表者名: Koichi Kokame
  • 学会等名: The 59th Annual Scientific and Standardization Committee Meeting
  • 発表場所: Amsterdam, The Netherlands
  • 年月日: 20130629-20130630
  • 招待講演
• [学会発表] ADAMTS13の正常な分泌にはシクロフィリンBによるプロリン残基異性化が必要である (2013)
  • 著者名/発表者名: 小亀浩市，秋山正志，宮田敏行
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形
  • 年月日: 20130530-20130601
• [学会発表] プロテインS徳島（PS-K196E）変異ノックインマウスの樹立と解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 坂野史明，喜多俊行，柳本広二，田嶌優子，小亀浩市，宮田敏行
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形
  • 年月日: 20130530-20130601
• [学会発表] 妊娠を契機に診断された新規の遺伝子変異を伴うUpshaw-Schulman症候群（USS）の一例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小堺貴司，森山雅人，布施一郎，柴崎康彦，増子正義，瀧澤淳，鳥羽健，吉田邦彦，小亀浩市，宮田敏行，松本雅則，藤村吉博，曽根博仁
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形
  • 年月日: 20130530-20130601
• [学会発表] マウス急性心筋梗塞モデルにおけるADAMTS13の心筋保護作用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 土井政明，松井英人，竹田征治，斎藤能彦，武田麻衣子，松成泰典，西尾健治，嶋緑倫，坂野史明，秋山正志，小亀浩市，宮田敏行，杉本充彦
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形
  • 年月日: 20130530-20130601
• [備考] 国立循環器病研究センター 研究所 分子病態部
  • URL: http://www.ncvc.go.jp/res/divisions/etiology/index.html