| 研究課題/領域番号 |
25440077
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
伊藤 敬 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (50373270)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Rab33B / HCV / Atg16L1 / オートファジー / 膜輸送 |
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| 研究実績の概要 |
世界人口の3%が罹患しているとされるC型肝炎は、肝硬変、肝癌のリスクを高める。そういった危険性にも関わらず、その原因ウィルス(HCV)の増殖のメカニズムはほとんど明らかになってない。HCVの様に膜で包まれたウィルスが増殖する場合、宿主細胞の膜輸送システムをハイジャックしている事が知られているため、本申請では細胞内膜輸送を司る低分子量Gタンパク質RabとHCV増殖の関係を明らかにする事を目的としている。また、過去にHCV増殖との関係が報告されているRab33Bは申請者によってオートファジー必須因子であるAtg16L1との結合が示されている。近年、細胞内自食作用であるオートファジーとHCV増殖との間にも深い関係があることが示唆されており、Rabタンパク質の中でも特にRab33Bの解析を行なう事で、膜輸送、オートファジー、HCV増殖という三者の関係を明らかにできると考えていた。しかしこれ迄のところ、自身の実験系においては、Rab33BやAtg16L1のノックダウンによるHCV複製への影響を観察することができなかった。そこで方針を変更し、Rabの網羅的な解析を行う事で、HCV複製に関与するRabを同定することを目的とした。現在HCV複製の宿主細胞として一般的に用いられているヒト肝癌細胞であるHuh7で、GFP融合型のRabを安定的に発現する細胞系列を作成することを行っている。またHCVの細胞内での複製メカニズムを観察するために、赤色蛍光タンパク質を融合したHCVの構成タンパク質、非構成タンパク質の発現プラスミドを作成する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
職場の移動に伴い実験環境が変化したため、実験の推進に大きな影響があった。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画に記した通り、すべてのRabタンパク質に関して網羅的にHCVの複製への寄与を検証してゆく。まず一次スクリーニングとして、HCVタンパク質との共局在性の検証を行なう。緑色蛍光タンパク質であるGFPを付加したRabを安定的に発現するHuh7細胞を作成する。レンチウィルスを用いた遺伝子導入を行なう予定である。また、HCVの局在を可視化するために、その構成タンパク質であるE1, E2と、複製には必要と考えられているが構成タンパク質ではないNS3, NS4Bに赤色蛍光タンパク質であるmStrawberryを付加した融合タンパク質が発現するベクターを作成する。共局在性が得られたRabに関してはノックダウン実験や、活性型、不活性型変異体Rabを発現させる事によってHCV複製への影響を調べる事で、Rabの関与がどのようなものかを明らかにしていく。
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