| 研究課題/領域番号 |
25440078
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
水野 智亮 筑波大学, 医学医療系, 助教 (80529032)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 小胞体ストレス / キナーゼ / ホスファターゼ |
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| 研究概要 |
膜タンパク質・分泌タンパク質は、生合成の初期段階に小胞体においてホールディングや糖鎖付加を受ける。小胞体におけるタンパク質の修飾は厳密に管理されており、高次構造に異常があるタンパク質は品質管理機構によって修復または除去される。さらに、化学的、物理的ストレスや遺伝的要因によって、未成熟なタンパク質や異常なタンパク質が小胞体内に蓄積した場合（小胞体ストレス）には、小胞体ストレス応答機構が機能することによって、未成熟タンパク質の成熟および異常タンパク質の修復と除去が効率的におこなわれる。近年、小胞体ストレスが神経変性疾患・虚血性疾患・糖尿病など様々な疾患の発病に関与することが報告されている。AMP活性化キナーゼ(AMPK)は進化上保存されたセリン/スレオニンキナーゼであり、細胞内のエネルギーセンサーとして重要な役割を担っている。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、AMPKオルソログであるSnf1がグルコース制限状態に対する適応に機能している。また、Snf1は熱・酸性条件などの環境ストレスに対する応答にも機能することが報告されていたが、小胞体ストレスにおける機能は知られていなかった。我々は、Snf1の小胞体ストレス応答への関与を検討し、Snf1が小胞体ストレス応答を負に制御する可能性を見出してきた。そこで本研究はSnf1による小胞体ストレス応答制御機構を明らかにすることを目的とした。今年度は、グルコース制限状態に対する適応においてSnf1の周辺で機能することが知られている因子について、遺伝子破壊株を作製し、小胞体ストレス感受性を検討した。その結果、Snf1はSnf4、Gal83と三量体を形成して小胞体ストレス応答を負に制御していること、リン酸化によるSnf1の活性化が小胞体ストレス応答における機能において重要であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Snf1の周辺で機能する因子を順調に明らかにすることができ、小胞体ストレス応答・Snf1活性を解析するための実験系を確立できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
小胞体ストレス応答におけるSnf1の機能にとってリン酸化は重要であると考えられたことから、小胞体ストレスによってSnf1のリン酸化状態が変化するかリン酸化型哺乳類AMPKに対する抗体を用いたウエスタンブロットによって調べる。続いて、昨年度明らかにしたSnf1のリン酸化を制御する因子の遺伝子破壊株におけるSnf1のリン酸化状態を野生型と比較する。また、Snf1がどのように小胞体ストレス応答を負に制御しているかを明らかにする。出芽酵母における小胞体ストレス応答ではIre1-Hac1経路、Mpk1やHog1などのストレス応答性MAPキナーゼ経路が機能している。Snf1とこれらの関連性について、Snf1・Snf1周辺因子の遺伝子破壊株においてIre1-Hac1経路、Mpk1やHog1の活性を調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実験系を最適化した結果、抗体等の比較的高額な試薬類、シャーレ等のプラスチック製品を含めた消耗品に費やす経費を削減できたため。
今年度は、Snf1による小胞体ストレス応答制御機構を分子レベルで明らかにしていくことを視野に入れている。Snf1はキナーゼであることから、その基質を同定することはもっとも重要な課題である。キナーゼと基質の関係性をクリアにする上でリン酸化型タンパク質を特異的に認識する抗体は極めて有用である。そのため抗体作製費を計上した。Snf1は遺伝子発現を制御することがよく知られている。そこで、必要に応じ、DNA microarray法による遺伝子発現解析をおこない、小胞体ストレスに応答した遺伝子発現の変化にSnf1が関与するか調べる。これらの実験に要する消耗品費を計上した。
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