| 研究課題/領域番号 |
25440116
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
野呂 知加子 日本大学, 生産工学部, 教授 (80311356)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 再生幹細胞 / 幹細胞増殖 / タンパク質機能解析 / ヤマトヒメミミズ / 無性生殖 / 細胞分化 / 細胞接着 / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、砕片分離と再生による無性生殖を行うヤマトヒメミミズEnchytraeus japonensisにおいて、再生初期に再生芽先端付近および中胚葉系列幹細胞に発現する新規遺伝子grimpに着目し、タンパク質レベルでその性質と機能を明らかにすることを目的とする。また、grimpタンパク質と相互作用するタンパク質、およびgrimp遺伝子の影響下にある他の遺伝子との関係を調べ、再生開始機構および再生幹細胞の実態の解明を目指す。これまでに、RNAiによるgrimp遺伝子の発現抑制が再生を阻害することを明らかにしているが、さらに直接的にgrimpの再生における役割を証明するために、タンパク質レベルの機能解析を行う。
平成26年度は、grimp遺伝子をHisタグ付きベクターに組換え、大腸菌にてIPTGによるタンパク質発現誘導と金属カラムによるアフィニティ精製を行った。精製したgrimpタンパク質を電気泳動で分離し、抗Hisタグ抗体によるウェスタンブロッティングにより確認の後、該当する融合タンパク質バンドを切り出して保存した。このタンパク質に対する抗体を作成準備中である。抗体を用いてタンパクの同定（プロセシングの有無）、タンパクレベルの局在（細胞の種類、細胞内局在）を示すと共に、機能阻害実験や免疫共沈降を用いた相互作用タンパク質の同定などを行う。
また、grimp-GFP（N端およびC端）融合ベクターを作成し、従来の哺乳類間葉系幹細胞株に加えてヒト肝臓上皮癌細胞株HepG2に強制発現させ、細胞増殖および細胞分化への影響について検討した。この細胞でも融合タンパクが発現し蛍光を発したが、細胞増殖に対する影響は見られなかった。この融合タンパク質についても電気泳動で分離し、抗GFP抗体によりウェスタンブロッティングにより確認の後、該当する融合タンパク質バンドを切り出して解析中である。さらに、このGFP融合タンパク質をミミズの再生芽に顕微注入し、GFPの蛍光を利用してその局在を調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
grimpタンパク質の精製については、従来よりベクターやタグを変更し、順調に進んでいる。タンパク質精製と抗原としての融合タンパク質の採取に成功し、抗体の作成に関しては、これから行う。grimp-GFP融合タンパク質については、N端とC端の両方の融合ベクターを作成し、異種細胞に強制発現することに成功した。また、抗GFP抗体によるウェスタンブロッティングでも発現を確認したので、生体内への注入を検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は引き続き、精製したタグ付きまたはGFP融合grimpタンパク質に対する抗体を作成し、機能霜害実験を行う。またこれらの融合タンパク質を再生芽に顕微注入して挙動を解析する。抗タグまたは抗GFP抗体を用いて、grimpタンパク質と共沈（相互作用）するタンパク質の探索を行う。grimp発現は増殖するネオブラスト(Neo) 等のvasa遺伝子を発現する中胚葉系再生幹細胞に見られる。grimpとvasaが同じ細胞に発現しているのかどうかについて、double ISHあるいは抗体染色を組み合わせることにより検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体作成用精製タンパク質を集めて、必要量ためていたため、抗体作成（外注）をこれから行う。抗体作成委託料分を繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
抗体作成委託分として使用する。
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