研究課題
基盤研究(C)
本研究では、植物のmRNA代謝制御機構に着目し、植物形態形成における遺伝子発現制御メカニズムの理解を目指す。まず、pre-mRNAのスプライシングに必須であるSF3b複合体の全構成因子を植物で同定し、研究基盤を整備する。酵母やヒトのSF3b構成因子を参考に、シロイヌナズナにおける相同因子群を同定した結果、7つのうち6つのサブユニットは複数の遺伝子がコードしていることが判明した。そこで、これらの遺伝子機能を順次解析する逆遺伝学的アプローチと、SF3bタンパク質複合体構成因子の同定する生化学的アプローチを進めている。これまでの成果は、国内外の学会、招待講演、国際雑誌論文などに発表した。以下その成果の一部を列記する。１）SF3b構成因子候補のSAP130が花粉形成に不可欠であることを報告したが、同SAP14bもまた、花粉形成に不可欠であることが判明したので、発生学的解析を進めている。２）また、SF3b構成因子候補のSAP49は胚発生において不可欠であることが判明し、解剖学的な解析を進めている。３）生化学的アプローチを目指して、SAP130とSAP49にタグをつけたコンストラクトを作製し、大腸菌、シロイヌナズナで発現する系を確立した。現在、これにより、植物粗抽出物を用いたpull down、植物生体からのpull downと免疫沈降条件の最適化を行なっている。つぎに、csn１変異体にCSN1遺伝子を発現する部分相補植物が、花粉形成過程に異常を示すことから、その解析を進めた。その結果、花粉形態形成異常が現れる時期や表現型がSAP130 RNAi植物のそれとよく似ていることを見出した。現在、標的遺伝子群の解析を進めている。
2: おおむね順調に進展している
現在までに計画通り研究が進展し、確実に成果を上げている。逆遺伝学的手法による、シロイヌナズナSF3b構成因子の機能解析は、順調に変異体を得て解析を進めている。複数コピーによってコードされるサブユニットは多重変異体を作製するとともに、サブユニット間の多重変異体作製も開始した。RNAi法などを用いて複数遺伝子のノックダウンも検討している。また、逆遺伝学的解析によって特定の形態形成過程への関与が示唆された遺伝子については、発現誘導植物、遺伝子マーカーの導入、などを進めている。生化学手手法による、シロイヌナズナSF3b構成因子同定に必要な道具もそろいつつある。現在、in vitroおよびin vivoな系を用いた。pull downと免疫沈降条件の最適化を行なっている。さらにCSN結合タンパク質であるPrp43の機能解析を進め、機能欠失変異植物を得たので解剖学的解析を進める一方、関連遺伝子群との多重変異体を作製している。今年度は、SAP130とSAP49の機能解析をモデルに、普遍性が高い制御を行なうmRNA代謝制御因子群が、いかにして特定の遺伝子転写を制御するのか、その分子機構を解明する。また、SF3bの解体に重要なPrp43 RNAヘリカーゼの機能解析を行ない、植物におけるmRNA代謝制御機構の理解を目指す。一方、SAP130とPrp43はタンパク質分解を制御するCSNと結合するので、mRNA代謝へのCSN機能の関与を解析する。これまでに、当初予想していなかった研究材料を獲得して、今後さらに効率的で相補的な研究の進展が期待できる。
今後は、すでに進めている研究を継承・発展させるとともに、mRNA代謝制御因子群が機能するのにタンパク質分解制御機構がどのように必要であるのかCSNとの相互作用解析を中心に、その分子メカニズムの理解を目指す。複合的アプローチを通じて、複雑な制御機構の全貌をひも解くことをめざし、これまでの実験に加えて新たに以下の２点に焦点を絞る。１）Prp43は、スプライソソームの解体とリボソーム生合成の、異なる2つの機能を担っている。Prp43は植物では2コピー存在する。相同因子間で機能的重複があるのか使い分けがあるのかが焦点となる。特にPrp43機能欠損植物 を単離する一方、RNAi法を用いた機能抑制する植物も作製して解析する。プロモーター活性解析、発現解析を組み合わせて植物におけるPrp43機能を解明する。さらに酵母やヒト培養細胞のpre-mRNAスプライシングのアッセイ系の活用、植物におけるこれらアッセイ系の確立を目指す。２）CSNとmRNA代謝制御因子の相互関係の理解 CSNはCSN1のアミノ末端を介してSAP130とPrp43と結合している。この結合部位に必須となるアミノ酸に点変異を 入れた植物を作製する。これによって、CSNと各々の結合因子との間の相互作用が担う生体内機能を素過程に分けて解析できると考えている。yeast two-hybrid法、免疫沈降法と合わせて、結晶構造解析を準備する。
すべて 2014 2013 その他
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 3件) 備考 (1件)
PLoS Genet
巻: 10 ページ: e1003954
10.1371/journal.pgen.1003954
Mol Plant
巻: 6 ページ: 1616-1629
10.1093/mp/sst045
http://www.scl.kyoto-u.ac.jp/~molbio/index.html
